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Apr 20, 2023

Plasma-Proteomanalyse von aktiven und trägen Mäusen

Wissenschaftliche Berichte Band 5,

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 16604 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Der Winterschlaf ist eine physiologische Anpassung zur Bewältigung extremer Umweltbedingungen. Sie zeichnet sich durch längere Phasen der Erstarrung aus, die im Winter durch vorübergehende Erregungszustände unterbrochen werden. Während der Erstarrung werden die Körperfunktionen unterdrückt und im Wachzustand schnell wieder auf das Niveau vor dem Winterschlaf zurückgeführt. Obwohl molekulare Studien an überwinternden Nagetieren und Bären durchgeführt wurden, ist unklar, wie verallgemeinerbar die Ergebnisse auf überwinternde Arten mit unterschiedlicher Physiologie wie Fledermäuse sind. Da bei kleinen Winterschlaftieren eine gezielte Blutproteomanalyse fehlt, untersuchten wir das allgemeine Plasmaproteomprofil des europäischen Myotis myotis und die mit dem Winterschlaf verbundenen Veränderungen zwischen trägen und aktiven Individuen mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese. Die Ergebnisse zeigten einen Wechsel von Proteinen, die am Transport, der Brennstoffumschaltung, der angeborenen Immunität und der Blutgerinnung zwischen den beiden physiologischen Zuständen beteiligt sind. Die Ergebnisse legen nahe, dass Stoffwechselveränderungen während des Winterschlafs mit Veränderungen des Plasmaproteoms verbunden sind. Die weitere Charakterisierung des proteomischen Plasmaprofils identifizierte Transportproteine, Gerinnungsproteine ​​und Komplementfaktoren und stellte eine hohe Häufigkeit von Alpha-Fetoprotein fest. Wir konnten zum ersten Mal ein grundlegendes Proteomprofil des myotiden Fledermausplasmas erstellen und außerdem eine modulierte Proteinexpression während der Erstarrung in Myotis myotis nachweisen, was auf neue physiologische Wege bei Fledermäusen im Allgemeinen und während des Winterschlafs im Besonderen hinweist.

Um Nahrungseinschränkungen und einen hohen Bedarf an Stoffwechselenergie im Winter zu überwinden, haben Tiere in gemäßigten Klimazonen Strategien wie Ernährungsumstellung, jährliche Wanderung, Winterruhe oder Winterschlaf entwickelt. Überwinternde Arten unterliegen einem zirkajährlichen Rhythmus zwischen Homöothermie (Aktivität) und Heterothermie (Winterschlaf), wobei der heterotherme Winterschlafzyklus zwischen ausgedehnten Phasen tiefer Erstarrung wechselt, unterbrochen von kurzen Wiedererwärmungsphasen, sogenannten Arousals1. Während der Torpidphase, die zwischen 6 und 40 Tagen dauert, sinkt die Stoffwechselrate auf 2 % des Normalwerts, was mit einer niedrigeren Körpertemperatur zwischen 10 °C und –2 °C, einer verringerten Herzfrequenz und längeren Atemintervallen einhergeht1,2,3. Während der Erregung werden die mit der Erstarrung einhergehenden physiologischen Veränderungen für 10–15 Stunden auf euthermische Werte zurückgeführt1. Als Folge der Stoffwechselunterdrückung wird das Immunsystem auch während der Erstarrung funktionell unterdrückt und während des Wachzustands wiederhergestellt, um Infektionen zu bekämpfen4.

Um den Mechanismus zu beschreiben, der dem circanualen Rhythmus des Winterschlafs zugrunde liegt, wurde ein Zwei-Übergangs-Modell vorgeschlagen, das einen Übergang von der Homöothermie zur Heterothermie und einen weiteren zyklischen Übergang innerhalb des heterothermen Zustands zwischen Erstarrung und Erregung bezeichnet5,6. Obwohl die genaue genetische und molekulare Regulation, die diesem Mechanismus zugrunde liegt, unklar bleibt, wurde gezeigt, dass der Wechsel von Homöothermie zu Heterothermie eher mit einer breiten unterschiedlichen Expression vorhandener Gene als mit der Entwicklung und Expression von Winterschlaf-spezifischen Genen verbunden ist7,8,9. Diese Expressionsunterschiede treten auf Proteinebene im Herzen10, Darm11, Leber12 und Skelettmuskeln13 von Erdhörnchen (Ictidomys tridecemlineatus) auf. In diesen Geweben wurden im aktiven Zustand erhöhte Expressionsniveaus von Proteinen beobachtet, die an der Glykolyse, Glykogenese und dem Aminosäurekatabolismus beteiligt sind, während der Winterschlaf durch eine erhöhte Expression von Proteinen gekennzeichnet war, die am Fettsäurekatabolismus beteiligt sind. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Verlagerung von Kohlenhydraten zur Lipidoxidation während des Winterschlafs14. Eine andere Studie, die das Nierenproteom derselben Spezies untersuchte, fand Hinweise auf einen Umsatz der Plasmaproteine ​​Alpha-2-Makroglobulin, Albumin und Apolipoprotein während der Torpor-Erregungs-Zyklen15.

Plasmaproteine ​​und ihre Zusammensetzung im Blut sind bekanntermaßen ein wichtiger Indikator für physiologische Veränderungen, einschließlich der Erkennung von Krankheiten oder einer Pathogeninfektion beim Menschen16. Daher können auch mit dem Winterschlaf verbundene Veränderungen in der Zusammensetzung der Blutplasmaproteine ​​nachweisbar sein. Bei asiatischen Streifenhörnchen (Tamias sibiricus asiaticus) wurden beispielsweise spezifische Proteine ​​im Plasma identifiziert, die mit dem Winterschlaf assoziiert sind17,18, während bei Erdhörnchen (Ictidomys tridecemlineatus) während des heterothermen Winterschlafzyklus veränderte Plasmametaboliten (z. B. Aminosäuren, regulatorische Lipide) festgestellt wurden wurden mithilfe nicht-zielgerichteter metabolomischer Ansätze charakterisiert19,20. Eine gezielte proteomische Analyse des Blutserums im Winterschlaf befindlicher amerikanischer Schwarzbären (Ursus americanus) ergab eine unterschiedliche Expression von Proteinen, die an Immunität, Gerinnung und Knochenstoffwechsel beteiligt sind21. Diese Ergebnisse liefern molekulare Unterstützung für die Besonderheiten des Ursiden-Winterschlafs, einschließlich der Wundheilung und der aktiven Immunfunktion während des Winterschlafs22. Im Gegensatz zu Bären ist der Winterschlaf von Nagetieren mit einer Immunsuppression verbunden4, was die Bedeutung der Forschung zur Blutproteomik bei kleinen Säugetieren im Winterschlaf unterstreicht, da es kein universelles proteomisches Profil für den Winterschlaf von Säugetieren gibt.

Die Forschung zum Winterschlaf von Säugetieren konzentrierte sich auf Nagetiere. Obwohl Informationen zu allgemeinen Regulierungsprozessen aus Gewebeproteomstudien an Nagetieren vorliegen, fehlt eine gezielte Analyse von Plasma- und Serumproteomprofilen. Auch wenn der Phänotyp des Winterschlafs zwischen den Arten in allen Taxa ähnlich ist, sind Unterschiede in den Mechanismen, die zu Veränderungen im Winterschlaf führen, unklar, insbesondere wenn physiologische Anpassungen während der Homöothermie berücksichtigt werden. Dementsprechend sind bei Nagetieren und Fledermäusen Ähnlichkeiten in den physiologischen Aspekten des Winterschlafs zu erwarten, z. B. Brennstoffwechsel vom Kohlenhydrat- zum Fettstoffwechsel, Verringerung der Proteinsynthese und andere. Andere Prozesse können jedoch aufgrund grundlegender Unterschiede in ihrer Physiologie einzigartig sein. Fledermäuse können das ganze Jahr über in einen heterothermen Zustand übergehen, indem sie auch im Sommer in Phasen längerer Erstarrung verfallen23, während die meisten Nagetiere im Winterschlaf nur während der Wintersaison Heterothermie zeigen. Fledermäuse sind auch die einzige Säugetiergruppe, die zu Motorflügen fähig ist und sich aufgrund einer erhöhten Stoffwechselkapazität und eines erhöhten Antioxidantienspiegels selektiert hat24. Darüber hinaus handelt es sich um ungewöhnlich langlebige Arten25, die sich in ihren Merkmalen von den bisher untersuchten Winternagern unterscheiden. Darüber hinaus machen die Fortpflanzungsmuster von Fledermäusen im Winterschlaf26,27 oder die Rolle der Flügelmembran bei der Aufrechterhaltung des Wasserhaushalts28 die Physiologie im Zusammenhang mit dem Winterschlaf der Chiropteren einzigartig. Es wurde vermutet, dass einige Fledermausarten während des Winterschlafs nicht immunsupprimiert sind, wie dies bei Nagetieren der Fall ist, und dass Fledermäuse spezifische Abwehrkräfte gegen psychrophile Krankheitserreger wie Pseudogymnoascus destructans aufrechterhalten29. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass sich einige der Regulierungsmechanismen von Fledermäusen im Winterschlaf von denen von Nagetieren unterscheiden sollten.

Um unser Wissen über den Winterschlaf von Chiropteren und den Winterschlaf von Kleinsäugern im Allgemeinen zu verbessern, verglichen wir das Blutplasma-Proteomprofil einer überwinternden europäischen Fledermausart, des Großen Mausohrs (Myotis myotis), mithilfe eines zweidimensionalen Gelelektrophorese-Ansatzes zur Charakterisierung unterschiedlich exprimierter Proteine ​​zwischen homöothermen und heterothermen, trägen Individuen. Im Vergleich zum Winterschlaf von Nagetieren sagen wir für Fledermäuse ein ähnliches Muster der Proteinexpression in allgemeinen Regulierungsmechanismen voraus, jedoch Unterschiede in der Regulierung von Proteinen, die an spezifischen physiologischen Prozessen wie Immunfunktion oder Fortpflanzung beteiligt sind.

Alle im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Tierschutz- und Ethikkommission des Leibniz-Instituts für Zoo- und Wildtierforschung genehmigt (Genehmigung Nr. 2010-05-01). Alle Experimente wurden gemäß den genehmigten Richtlinien des Leibniz-Instituts für Zoo- und Wildtierforschung durchgeführt.

Große Mausohren (M. myotis) wurden in Nordbayern (Deutschland) mit der Lizenz der Landesregierungen gefangen (Genehmigungen 54-2532.2-9/10, 55.1-8642G062/10 und 55.1-8642-01-17/10). ). Blutproben von 14 männlichen Individuen im homöothermen aktiven Zustand (n = 7) wurden im September 2010 und von trägen Individuen (n = 7) während der Winterschlafperiode im März 2011 entnommen. Aktive Individuen wurden mit Nebelnetzen (Ecotone, Polen) gefangen träge Individuen wurden von Hand aus den Wänden der Hibernacula gepflückt. Blutproben wurden bei aktiven Fledermäusen aus der Vena uropatagialis mit sterilen Nadeln und durch Übertragen von Bluttröpfchen in heparinisierte Mikrokapillarröhrchen und bei trägen Fledermäusen aus der Halsvene mit einer sterilen heparinisierten Nadel und Spritze entnommen. Alle Fledermäuse wurden am Fangort freigelassen, nachdem die Entblutung abgeschlossen war. Strukturelle und funktionelle immunologische Messungen wurden an frischem Blut durchgeführt, während bei überschüssigem Blut das Plasma durch Zentrifugation abgetrennt und bis zur weiteren Analyse bei –80 °C gelagert wurde.

Proteomische Profile wurden aus Blutplasmaproben von 14 männlichen M. myotis-Individuen (7 homöotherme, aktive Individuen und 7 heterotherme, träge Individuen) mithilfe von 2-D-DIGE bestimmt.

Serumalbumin ist das am häufigsten vorkommende Plasmaprotein beim Menschen16 und kann den Nachweis und die Quantifizierung von Plasmaproteinen mit geringer Häufigkeit erschweren30. Daher wird bei Plasmauntersuchungen häufig Albumin vor der Analyse abgebaut. Allerdings kann der Albuminabbau auch unerwünschte Proteine ​​entfernen31. In dieser Studie wurde kein Albuminabbau durchgeführt, Serumalbumin wurde jedoch bei der massenspektrometrischen Identifizierung ausgeschlossen.

Die Gesamtproteinkonzentration im Plasma wurde mit einem NanoDrop® bestimmt und in Markierungspuffer [50 mM Tris, 5 mM EDTA, 5 % v/v Glycerin, pH 7,2; Endvolumen = 9 μL] für die Fluoreszenzproteinmarkierung mit S-Dye300 des Saturn-2DTM-Markierungskits (NH DyeAGNOSTICS GmbH, Deutschland) gemäß Herstellerprotokoll. Ein interner Standard (IS), bestehend aus allen in jedem experimentellen Verfahren verwendeten Proben, wurde in Markierungspuffer auf die erforderliche Konzentration von 0,55 μg Protein/μL verdünnt (Endvolumen = 9 μL) und mit S-Dye200 der Saturn-2DTM-Markierung fluoreszenzmarkiert Bausatz.

Markierte Proben (pro Gel: 9 µL einer einzelnen S-Dye300-markierten Probe + 9 µL S-Dye200-markierter IS) wurden in 432 µL Rehydrierungspuffer [8 M Harnstoff, 1 % w/v 3-[(3-Cholamidopropyl) verdünnt )Dimethylammonio]-1-propansulfonathydrat (CHAPS), 13 mM Dithiothreitol (DTT), 0,5 % v/v Servalyt (SERVA Electrophoresis GmbH, Deutschland)] und geladen auf IPG BlueStrips pH 3–10 NL/24 cm (SERVA Electrophoresis GmbH). , Deutschland) für die aktive (50 V, 15 h) Probe-in-Gel-Rehydratisierung mit PROTEAN® IEF Cell Tray (Bio-Rad, USA). Die isoelektrische Fokussierung wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Schritt 1, 300 V, 150 V/h schnell; Stufe 2, 600 V, 300 V/h schnell; Stufe 3, 1500 V, 750 V/h schnell; Stufe 4, 3000 V, 48000 V/h schnell; Stufe 5, 6000 V, 10000 V/h schnell; Schritt 6, 300 V, 5 h; insgesamt 60700 V/h.

Vor der Trennung in der zweiten Dimension wurden IPG-Streifen in Äquilibrierungspuffer [EB: 6 M Harnstoff, 2 % SDS, 0,375 M Tris, 20 % Vol./Vol. Glycerin] mit zunächst 20 mg/ml DTT für 15 Minuten äquilibriert, gefolgt von EB mit 25 mg/ml Jodacetamid (IAA) für 15 Minuten. Nach der Äquilibrierung wurden die Streifen auf 15 % SDS-Gele in 27,5 × 22 cm großen Glaskassetten mit geringer Fluoreszenz (NH DyeAGNOSTICS GmbH, Deutschland) gelegt und mit 1 % Agarose einschließlich Bromphenolblau überschichtet. Die Gelelektrophorese wurde in einer SE900-Elektrophoreseeinheit (Hoefer Inc., USA) für mindestens 1900 V/Stunden und maximal 2200 V/Stunden bei 80 mA/Gel, 100 W und 100 V durchgeführt. Es wurde eine Bildgebung der Gele durchgeführt durch Fluoreszenzscannen auf einem Typhoon 9400 Imager (GE Healthcare, USA) bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 532/576 nm (S-Dye200) und 633/664 nm (S-Dye300).

Um das Expressionsmuster der durch 2-D-DIGE getrennten Proteinflecken zu bewerten, wurden alle Probengele mit der Delta2D-Software (DECODON, Deutschland) analysiert. Ein IS S-Dye200-Bild wurde basierend auf der größten Anzahl erkennbarer Flecken als Master-Gel bestimmt und dann durch eine „Probe im Gel“-Warping-Strategie in der Delta2D-Software mit allen Bildern verbunden. Das Warping von Gelen erfolgte durch die Definition übereinstimmender Vektoren zwischen verschiedenen Proteinpunkten, die automatisch und manuell ausgewählt wurden. Zur Expressionsanalyse von Proteinspots wurde ein fusioniertes Bild aller Probenbilder (S-Dye300; Gelbilder jeder Probe sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt) erstellt und ein Konsens-Spotmuster zur Normalisierung gegen IS-Bilder angewendet. Übereinstimmende Proteinflecken, die in allen Probenbildern vorhanden waren und eine mindestens 1,5-fache Änderung zwischen aktivem und torpidem Zustand aufwiesen, wurden mithilfe eines nichtparametrischen Wilcoxon-Rank-Sum-Tests (Alpha: p < 0,05) mit der Delta2D-Statistiksoftware TMeV (Decodon) statistisch analysiert.

Zur präparativen Geltrennung wurden gepoolte Proben aller 14 Personen verwendet. Für die erste Dimension wurde unmarkiertes gepooltes Plasma (Gesamtproteinkonzentration = 240 μg) auf einen IPG-Streifen geladen und wie oben beschrieben nach isoelektrischen Punkten getrennt. Die Trennung nach Molekulargewicht in der zweiten Dimension wurde ebenfalls wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass eine 28 × 21 cm große Glaskassette mit Scharnier (Hoefer Inc., USA) anstelle von Glaskassetten mit geringer Fluoreszenz verwendet wurde. Nach der 2-D-Gelelektrophorese war das Gel mit Coomassie-Blau-Farbstoff gefärbt [0,02 % Coomassie-Blau G-250; 5 % w/v Aluminiumsulfat; 10 % v/v Ethanol; 2 % v/v ortho-Phosphorsäure in dH2O] für 4 Stunden und dann entfärbt [10 % Ethanol; 2 % v/v ortho-Phosphorsäure in dH2O], um ungebundenes Coomassie-Blau32 zu entfernen. Zur Proteinidentifizierung wurden Spots mit einer Fold-Change-Differenz von ≥1,5 und einer statistischen Signifikanz von p < 0,05 zwischen dem aktiven und torpiden Zustand ausgewählt. Es war nicht möglich, alle unterschiedlich ausgeprägten Flecken auszuwählen, da nicht alle Flecken auf dem mit Coomassie-Blau gefärbten Gel unterscheidbar waren. Zusätzliche Spots für eine grundlegende Untersuchung des Fledermausplasma-Proteoms wurden aufgrund eines deutlichen Erscheinungsbilds im präparativen Gel und der Co-Lokalisierung mit unterschiedlich exprimierten Proteinspots ausgewählt. Interessante Proteinflecken wurden manuell ausgewählt und bis zur massenspektrometrischen Analyse in Eppendorf-Röhrchen mit 5 % v/v Essigsäure (in dH2O) bei 4 °C gelagert.

Ausgeschnittene Gelflecken wurden mit Wasser, 25 mM Ammoniumbicarbonat in Acetonitril/Wasser (1:1) und 50 mM Ammoniumbicarbonat gewaschen, durch Dehydratisierung in Acetonitril geschrumpft und in einer Schnellvakuumzentrifuge getrocknet. Die trockenen Gelstücke wurden in 20 μl 50 mM Ammoniumbicarbonat mit 50 ng Trypsin (Sequenzierungsgrad modifiziert, Promega) rehydratisiert. Nach Inkubation bei 37 °C über Nacht wurde die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 20 μl 0,5 % (v/v) Trifluoressigsäure in Acetonitril beendet, die Flüssigkeit abgetrennt, unter Vakuum zur Trockne eingedampft und die tryptischen Peptide darin wieder aufgelöst 6 μL 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure, 5 % (v/v) Acetonitril in Wasser.

Die MALDI-Massenspektrometrie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt33. Kurz gesagt, die Peptide wurden auf einer C18 RP-Minisäule (ZipTip C18, Millipore, Bedford, MA) gereinigt und unter Verwendung einer Alpha-Cyano-Hydroxyzimtsäure-Matrixlösung direkt auf die MALDI-Zielplatte eluiert. MS- und MS/MS-Messungen wurden mit einem MALDI-TOF-TOF-Gerät (AB SCIEX TOF/TOF 5800; Applied Biosystems, Framingham, MA, USA) durchgeführt, das mit einem Neodym-dotierten Yttrium-Lithiumfluorid-Laser (Nd:YLF, 349 nm) ausgestattet war ). MS-Spektren wurden im Positivionenreflektormodus durch die Akkumulation von 5000 aufeinanderfolgenden Laserschüssen aufgenommen. Für MS/MS wurden maximal 20 Vorläuferionen automatisch ausgewählt. Zur Verarbeitung der Spektren wurde GPS Explorer (Version 3.6, Applied Biosystems) verwendet.

LC-MS/MS-Analysen wurden auf einem LTQ-Orbitrap XL-Massenspektrometer (Thermo Fisher) durchgeführt, das mit einem Ultimate 3000 nanoLC-System (Thermo Scientific) ausgestattet war. Zur Trennung tryptischer Peptide wurde eine Kapillarsäule (PepMap100, C18, 3 μm, 100 Å, 250 mm × 75 μm ID, Thermo Scientific) verwendet. Die Elution erfolgte mit einer Flussrate von 300 nL/min unter Verwendung eines Gradienten von 3–50 % B in 30 min. Die mobile Phase A enthielt 0,1 % Ameisensäure in Wasser und die mobile Phase B enthielt 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril. Massenspektren wurden in einem datenabhängigen Modus mit einem MS-Durchmusterungsscan (mit einer Auflösung von 60.000) im Orbitrap und MS/MS-Scans der fünf intensivsten Vorläuferionen im linearen Fallenquadrupol erfasst. Die dynamische Ausschlusszeit für Vorläuferionen wurde auf 90 s eingestellt und die automatische Verstärkungsregelung wurde für Orbitrap-MS auf 1 × 106 und für LTQ-MS/MS-Scans auf 10.000 eingestellt. Zur Erstellung von Peaklisten wurde die Mascot Distiller Quantitation Toolbox (Matrix Science) verwendet.

Die verarbeiteten MS-Daten wurden auf einem MASCOT-Server (Mass Spectral Search Algorithm) (Version 2.2.2, Matrix Science Ltd, London) analysiert und intern mit der Säugetier-Teilmenge der NCBI-Datenbank (Version 221013; 33.055.681 Sequenzen) durchsucht. Für MALDI-MS wurde die Massentoleranz der Vorläufer- und Sequenzionen auf 100 ppm bzw. 0,35 Da eingestellt. Für LC-MS/MS wurde die Massentoleranz der Vorläufer- und Sequenzionen auf 10 ppm bzw. 0,35 Da eingestellt. Es waren maximal zwei fehlende Spaltungen erlaubt. Als variable Modifikationen kamen die Methioninoxidation und die Acrylamidmodifikation von Cystein zum Einsatz. Ein Protein wurde als identifiziert akzeptiert, wenn der gesamte MASCOT-Score über dem Signifikanzschwellenwert lag und mindestens zwei Peptide zum ersten Mal im Bericht auftauchten und die am höchsten bewerteten Peptide waren (Peptidübereinstimmungen aller identifizierten Proteine ​​sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt). Für MALDI-Daten betrug der Protein-Score −10*log(p), wobei p die Wahrscheinlichkeit ist, dass es sich bei der beobachteten Übereinstimmung um ein Zufallsereignis handelt, z. B. sind Protein-Scores über 75 signifikant (p < 0,05). Für LC-MS/MS-Daten betrug der Ionen-Score −10*log(p), wobei p die Wahrscheinlichkeit ist, dass es sich bei der beobachteten Übereinstimmung um ein zufälliges Ereignis handelt, z. B. individuelle Ionen-Scores >41 weisen auf Identität oder umfassende Homologie hin (p < 0,05). .

Bei der Betrachtung aller Gelbilder haben wir mithilfe eines Konsens-Spotmusters insgesamt 204 übereinstimmende Proteinflecken in allen Einzelproben entdeckt. Von 204 Protein-Spots zeigten 13 Protein-Spots (6,4 %) eine signifikante (p < 0,05) unterschiedliche Expression mit einem minimalen 1,5-fachen Unterschied zwischen den beiden physiologischen Zuständen, wobei im Vergleich neun Protein-Spots herunterreguliert und vier hochreguliert waren in den aktiven Zustand (Abb. 1 und Tabelle 1).

Myotis myotis Plasmaproteom.

Fusionsbild repräsentativer Bilder von mit S-Farbstoff markierten aktiven und torpiden Plasmaproben von M. myotis, getrennt durch 2-DIGE. Differenziell exprimierte Proteinflecken (p < 0,05; minimale Faltungsänderung 1,5) werden entweder grün für hochregulierte oder rot für herunterregulierte Proteine ​​während der Erstarrung angezeigt und durch Zahlen entsprechend Tabelle 1 angezeigt. Proteinflecken, die mittels Massenspektrometrie identifiziert wurden, sind unterstrichen . Der pH-Bereich des IPG-Streifens ist oben im Bild angegeben.

Wir waren nicht in der Lage, alle differenziell exprimierten Proteinflecken auf dem Coomassie-gefärbten Gel zu bestimmen und auszuwählen. Die Proteinidentifizierung (IDs) war für 5 von 13 differentiell exprimierten Proteinspots (S1/C7, S4/C15, S5/C16, S6/C17 herunterreguliert; S2/C3 hochreguliert) erfolgreich, bei denen MS-Daten mehrere Protein-IDs ergaben für 3 Proteinspots (S1/C7, S5/C16, S6/C17) und einzelne Protein-IDs für 2 Proteinspots (S2/C3, S4/C15). Für mehrere Protein-IDs sind die drei am besten bewerteten MS-Peptid-Übereinstimmungen in Tabelle 1 aufgeführt, mit Ausnahme von Übereinstimmungen mit Serumalbumin.

Die Proteine ​​stimmen mit denen überein, die in Myotis davidii und Myotis brandtii identifiziert wurden, basierend auf einer MASCOT-Suche in der NCBI-Datenbank. Die im torpiden Zustand deutlich herunterregulierten Proteine ​​wurden als Vitamin-D-bindendes Protein, vaskuläres nicht-inflammatorisches Molekül 3, Anti-Thrombin III (mehrere Protein-IDs von Spot S1/C7), Serotransferrin (S4/C15; S5/C16; S6/C17), ß-Kette von Fibrinogen (S6/C17) und Alpha-Fetoprotein (S5/C16). Das deutlich hochregulierte Protein bei Erstarrung (S2/C3) wurde als Kininogen-1 identifiziert (Tabelle 1).

Um ein allgemeines proteomisches Profil von Fledermausplasma zu beschreiben, wurden 27 Proteinflecken, die sich gleichzeitig mit unterschiedlich exprimierten Proteinflecken befanden, zur Analyse ausgewählt (Abb. 2). Für 18 von 27 ausgewählten Proteinspots ergaben die MS-Daten mehrere Protein-IDs. Die ersten drei Ränge der MS-Peptid-Übereinstimmungsergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt, mit Ausnahme der Übereinstimmungen mit Serumalbumin. Die identifizierten Proteine ​​stimmten mit den in Myotis davidii und Myotis brandtii identifizierten Proteinen überein, basierend auf MASCOT-Suchen in der NCBI-Proteindatenbank. Insgesamt ergab die MS 20 verschiedene Protein-IDs, von denen 12 Protein-IDs an mehr als einem Proteinpunkt auftraten. Zu den Protein-IDs, die in zahlreichen Protein-Spots auftraten, gehörten Alpha-Fetoprotein (20 Protein-Spots (PS)), Serotransferrin (7 PS), Anti-Thrombin III (6 PS), Vitamin-D-bindendes Protein (6 PS) und die Hämoglobin-Untereinheit Beta (5). PS), Komplement C4A (3 PS), Fibrinogen-Beta-Kette (3 PS), vaskuläres nicht-inflammatorisches Molekül 3 (3 PS), Alpha-1-Antitrypsin (2 PS), Hämoglobin-Untereinheit Alpha (2 PS), Hämoglobin-Alpha-Kette (2 PS) und Kininogen-1 (2 PS). In einzelnen Proteinspots gefundene Protein-IDs waren Kininogen-2 (C1), Komplement C3 (C13), NSFL1-Cofaktor p47 (C18), Apolipoprotein AV (C19), Chain-A-Profilin-Beta-Actin (C20), Carboanhydrase 2 (C24). ), Adeninphosphoribosyltransferase (C26), Apolipoprotein M (C29) und Dihydroorotatdehydrogenase (C30) (Tabelle 2). Protein-IDs, die in mehr als einem Proteinspot auftraten, befanden sich in ähnlichen Gelregionen (C2, C4, C6, C8 und C9; C11 und C12). Erwarten Sie die Protein-IDs Alpha-Fetoprotein, Fibrinogen, Serotransferrin und Hämoglobin-Untereinheit Beta, die sich in Proteinspots befanden über alle Gelregionen verteilt.

Coomassie-Gel des Plasmaproteoms von Myotis myotis.

Präparatives Coomassie-Gel aller 14 Plasmaproben (gepoolt), getrennt durch zweidimensionale Gelelektrophorese. Der pH-Bereich des IPG-Streifens ist oben im Bild angegeben. Proteinnummern zeigen Spots an, die aufgrund der Co-Lokalisierung mit hibernationsspezifischen, differentiell exprimierten Proteinspots ausgewählt wurden und im präparativen Gel ein deutliches Erscheinungsbild aufweisen.

Wir beobachteten eine unterschiedliche Expression für 13 von 204 nachweisbaren Flecken zwischen dem aktiven und torpiden Zustand, was 6,4 % der gesamten nachgewiesenen Proteinflecken entspricht, ein ähnlicher Anteil, der durch gezielte Serum-Proteomanalyse bei amerikanischen Schwarzbären beobachtet wurde21. Das Muster der Proteingelflecken zeigte eine elektrophoretische Ansammlung von Proteinflecken, was auf das Vorkommen mehrerer Proteinisoformen schließen lässt. Die Plasmaproteinsignatur unterschied den trägen Zustand deutlich von der aktiven Homöothermie, was mit der beobachteten Variation im Gewebe anderer Säugetierarten im Winterschlaf übereinstimmt10,11,12,13,14. Die massenspektrometrische Analyse identifizierte sieben unterschiedlich regulierte Proteine. Die meisten von ihnen waren herunterreguliert (Vitamin-D-bindendes Protein (DBP), Serotransferrin (TF), vaskuläres nicht-inflammatorisches Molekül 3 (VANIN-3), Alpha-Fetoprotein (AFP), Fibrinogen-Beta-Kette (FIG-β) und Anti- Thrombin III (AT)), wohingegen Kininogen-1 (KNG1) hochreguliert war.

Die herunterregulierten Proteine ​​TF, AFP und DBP werden aufgrund ihrer primären Funktion, lebenswichtige Stoffwechselprodukte, Vitamine oder Metallionen im Körper zu binden, als Transportproteine ​​klassifiziert. Das eisenbindende Glykoprotein TF spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären und systemischen Eisenhomöostase, insbesondere während langer Fastenperioden34. DBP und AFP gehören zur Albumin-Genfamilie des Menschen und spielen im Plasma multifunktionale Rollen. DBP ist ein wichtiger Transporter von Vitamin D3 und seinen Metaboliten und kommt als freies Plasmaprotein und auch auf der Oberfläche vieler Zelltypen, einschließlich Blutzellen, vor35,36. Im Gegensatz dazu kommt AFP hauptsächlich als freies Plasmaprotein in zahlreichen polymeren Formen vor37. AFP ist an der Bindung und dem Transport mehrerer Metaboliten beteiligt, darunter Fettsäuren, Bilirubin und Östrogene oder Metallionen bei menschlichen Föten und anderen Säugetieren37,38,39. Die Herunterregulierung dieser Transportproteine ​​könnte auf die verringerte Stoffwechselrate überwinternder Arten zurückzuführen sein3. Im Einklang mit dieser Hypothese zeigten Studien an Ratten mit eingeschränkter Ernährung niedrigere mRNA-Spiegel von DBP und eine Abnahme des exprimierten DBP in der Leber während des Fastens40,41. Darüber hinaus sind TF und DBP an der Modulation der angeborenen Immunität beteiligt42,43,44 und DBP spielt eine besonders wichtige Rolle bei der Aktivierung von Makrophagen45. Daher deutet eine Herunterregulierung auf eine Verringerung der angeborenen Immunität während des Winterschlafs hin4.

VANIN-3 ist eine Amidohydrolase, die am Abbau von Coenzym A (CoA) aus Pantothensäure (Vitamin B5) beteiligt ist. CoA und sein Thioester bilden Acetyl-CoA und sind wesentliche Cofaktoren für die Aufrechterhaltung des Fettsäuregleichgewichts46. Während des Winterschlafs wird ein Wechsel von der Glykolyse zur Oxidation von Triacylglycerinen beobachtet14, wodurch die Fettsäuren des Fettgewebes zur primären Energiequelle werden. Allerdings ist die Funktion von VANIN-3 beim CoA-Katabolismus kaum verstanden. Eine Herunterregulierung während des Winterschlafs könnte auf einen alternativen Abbau von CoA hindeuten, der den Wechsel von Glukose zu Triacylglycerinen als Energiequelle widerspiegelt.

Die differenziell exprimierten Proteine ​​FIG-β, AT und KNG1 sind Teil des Blutgerinnungssystems. FIG-β bildet zusammen mit anderen Proteindomänen das lösliche Glykoprotein Fibrinogen, das bei der Bildung von Blutgerinnseln durch Thrombin in unlösliches Fibrin umgewandelt wird47. Der Serinproteaseinhibitor AT baut Proteasen der Gerinnungskaskade ab, um die Gerinnung zu regulieren und Thrombosen vorzubeugen48. Im Gegensatz dazu ist KNG1 Teil des Kallikrein-Kinin-Systems und ist bekanntermaßen in vielen Signalwegen essentiell, darunter Thrombose, Gefäßpermeabilität und Entzündung49. Während des Winterschlafs ist die Blutplättchenaggregation bei Braunbären (Ursus arctos) reduziert50. Außerdem wurde ein Anstieg des Proteaseinhibitors Alpha-2-Makroglobulin im Serum von überwinternden Erdhörnchen und Schwarzbären beobachtet, was mit einer verminderten Gerinnung vereinbar ist21,51. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass KNG1 bei Schwarzbären im Winterschlaf herunterreguliert ist21. Eine Verringerung der Gerinnungsaktivität während des Winterschlafs könnte das Individuum vor Blutgerinnseln in Zeiten niedriger Herzfrequenz und verringertem Blutfluss schützen1,52. Das Expressionsmuster von herunterreguliertem AT und hochreguliertem KNG1 in M. myotis könnte jedoch auf eine erhöhte Gerinnungskapazität hinweisen. In ähnlicher Weise wurde eine Hochregulierung gerinnungsassoziierter Gene bei Myotis brandtii im Winterschlaf auf Transkriptionsebene beschrieben25. Im Gegensatz dazu kann eine Herunterregulierung von FIG-β während der Erstarrung bei M. myotis zu einer Verringerung der Gerinnungskapazität führen53. Basierend auf den widersprüchlichen Erkenntnissen zu Proteinen, die an der Koagulation in M. myotis beteiligt sind, schließen wir, dass die nachgewiesenen koagulationsassoziierten Proteine ​​möglicherweise an anderen physiologischen Prozessen beteiligt sind, die für den Winterschlaf relevant sind. Dies kann darauf hindeuten, dass Fledermäuse im Vergleich zu anderen Säugetieren eine andere Gerinnungskaskade haben, da es unwahrscheinlich ist, dass eine erhöhte Gerinnung während des Winterschlafs von Vorteil wäre.

Um ein grundlegendes Plasma-Proteomprofil bei Fledermäusen zu erstellen, wurden 27 klar definierbare Proteinflecken identifiziert, die sich gleichzeitig mit Winterschlaf-spezifischen, unterschiedlich exprimierten Proteinflecken befinden. Die MS-Proteinidentifizierung ergab mehrere IDs pro Proteinspot (Tabelle 2) und IDs, die in mehr als einem Proteinspot gefunden wurden, einschließlich unterschiedlich exprimierter Proteinspots, was auf das gleichzeitige Auftreten verschiedener Isoformen schließen lässt, die unterschiedlich reguliert werden können54. Die meisten identifizierten Proteine ​​sind bekanntermaßen die am häufigsten vorkommenden Proteine ​​im menschlichen Plasma16, darunter TF, FIG-β, Alpha-1-Antitrypsin und Komplement C3. Basierend auf ihren primären Funktionen könnten weitere identifizierte Proteine ​​in Transportproteine ​​(z. B. Hämoglobin, Apolipoprotein AV und M), Gerinnungsproteine ​​(z. B. AT, Kininogen I und II) und Proteine ​​des Komplementsystems (z. B. Komplementfaktor C4A und C3) eingeteilt werden. und Proteine, die an verschiedenen Regulierungsprozessen beteiligt sind (z. B. Carboanhydrase). Alle identifizierten Proteine ​​in M. myotis können in einem allgemeinen Plasmaprofil von Menschen gefunden werden16, was auf Ähnlichkeiten in der Plasmaproteinzusammensetzung zwischen Säugetiertaxa hinweist. Allerdings zeigte AFP bei der Identifizierung in 21 von 34 ausgewählten Proteinflecken ein ungewöhnliches Profil, was auf eine hohe Häufigkeit im Plasma erwachsener M. myotis schließen lässt. Beim Menschen ist AFP das am häufigsten vorkommende Protein während der fetalen Entwicklung und hat eine ähnliche Funktion wie Serumalbumin bei Erwachsenen, einschließlich der Bindung hydrophober Liganden wie Fettsäuren, Metaboliten und auch Metallionen35,36,37. Die Häufigkeit von AFP im Plasma erwachsener Fledermäuse legt nahe, dass dieses Protein möglicherweise eine wichtige funktionelle Rolle bei verschiedenen Mechanismen in M. myotis, möglicherweise bei Fledermäusen im Allgemeinen, spielt und daher weitere wissenschaftliche Aufmerksamkeit verdient.

Die Proteinidentifizierung wurde durch das Fehlen von Proteindatenbanken für Nicht-Modell-Wildtierarten behindert. Homologe Proteine ​​anderer Spezies weisen nicht immer eine 100-prozentige Sequenzähnlichkeit mit unbekannten M. myotis-Proteinen auf, wodurch sich die Menge potenziell analysierbarer tryptischer Peptide pro Protein abhängig vom Grad der Ähnlichkeit verringert, der die Rangfolge der Peptidübereinstimmung beeinflusst. Dieser Mangel an Wissen wird sich sicherlich ändern, wenn sich die Proteomforschung an Nicht-Modellarten weiterentwickelt55. Dennoch konnten wir ein grundlegendes Plasma-Proteomprofil für M. myotis erstellen. Darüber hinaus zeigten wir eine unterschiedliche Expression von Plasmaproteinen bei Fledermäusen im Winterschlaf im Vergleich zu aktiven Fledermäusen und zeigten eine Modulation von Proteinen, die am Transport, der Brennstoffumstellung von Kohlenhydrat- auf Triacylglycerinoxidation, der angeborenen Immunität und der Blutgerinnungskaskade beteiligt sind. Darüber hinaus lieferte die Proteinidentifizierung weiterer Proteinflecken Hinweise auf eine alternative Zusammensetzung von häufig vorkommenden Plasmaproteinen in M. myotis, wobei AFP möglicherweise ein prominentes Protein im Plasma erwachsener Fledermäuse ist. Das Proteomprofil des Chiroptera-Überwinterungsproteoms stimmte im Allgemeinen mit dem anderer überwinternder Arten auf der Signalwegebene überein, wie vermutet, mit Ausnahme der Koagulation, die spezifisch für Myotisfledermäuse zu sein scheint. Weitere Vergleiche mit Nagetieren und Bären werden die allgemeinen Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den Proteomprofilen überwinternder Arten verdeutlichen, insbesondere da sich die Proteindatenbanken verbessern und die Identifizierung erleichtert wird.

Zitierweise für diesen Artikel: Hecht, AM et al. Plasma-Proteomanalyse von aktiven und trägen Großen Mausohren (Myotis myotis). Wissenschaft. Rep. 5, 16604; doi: 10.1038/srep16604 (2015).

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Wir danken Simon Ghanem, Matthias Hammer, Daniel Lewanzik, Katja Pohle, Zaida Renteria-Solis, Jaap van Schaik, Karin Schneeberger, Bernhard Walk und Gudrun Wibbelt für ihre Hilfe bei der Feldarbeit und Probensammlung. Darüber hinaus möchten wir Angelika Bondzio und Ralf Einspanier für ihre Hilfe bei der Bildgebung und Jörns Fickel für die kritische Lektüre früher Entwürfe des Manuskripts danken. Die von zwei anonymen Gutachtern erhaltenen Kommentare haben die Qualität der vorliegenden Arbeit erheblich verbessert. Die Forschung wurde durch Mittel der International Max Planck Research School for Infectious Diseases and Immunology und des Leibniz-Instituts für Zoo- und Wildtierforschung, Berlin, unterstützt.

Leibniz-Institut für Zoo- und Wildtierforschung, Alfred-Kowalke-Straße 17, Berlin, 10315, Deutschland

Alexander M. Hecht, Beate C. Braun, Christian C. Voigt, Alex D. Greenwood & Gábor Á. Czirják

Leibniz Institute for Molecular Pharmacology, Robert-Rössle-Straße 10, Berlin, 13125, Germany

Eberhard Krause

Department of Animal Behaviour, Freie Universität Berlin, Takustraße 3, Berlin, 14195, Germany

Christian C. Voigt

Department of Veterinary Medicine, Freie Universität Berlin, Oertzenweg 19b, Berlin, 14163, Germany

Alex D. Greenwood

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G.Á.C. konzipierte die Studie; AMH führte alle Laborexperimente außer MS unter der Aufsicht von BCB durch und EK führte die MS-Experimente durch; AMH, EK und BCB analysierten die Daten; CCV arbeitete an den Genehmigungen und sammelte zusammen mit G.Á.C die Proben; AMH, BCB, EK, ADG und G.Á.C. besprach die Ergebnisse und verfasste das Manuskript. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript kommentiert, gelesen und genehmigt.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hecht, A., Braun, B., Krause, E. et al. Plasma-Proteomanalyse von aktiven und trägen Großen Mausohren (Myotis myotis). Sci Rep 5, 16604 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16604

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Eingegangen: 17. März 2015

Angenommen: 15. Oktober 2015

Veröffentlicht: 20. November 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16604

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