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Apr 14, 2023

Phosphorylcholin

Band Nature Communications

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5613 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Bildgebung und Biopsie von Sentinel-Lymphknoten ist für die klinische Beurteilung von Krebsmetastasen wichtig, und im Laufe der Jahre wurden aktiv neue nichtradioaktive lymphografische Tracer erforscht. Hier entwickeln wir molekulare Goldcluster (Au25), die durch Phosphorylcholin (PC)-Liganden funktionalisiert sind, für die NIR-II-Fluoreszenzbildgebung (1000–3000 nm) von dränierenden Lymphknoten in 4T1-Mäuse-Brustkrebs- und CT26-Dickdarmkrebs-Tumor-Mausmodellen. Die Au-Phosphorylcholin (Au-PC)-Sonden zeigen ein „Super-Stealth“-Verhalten mit geringen Wechselwirkungen mit Serumproteinen, Zellen und Geweben in vivo, was sich vom Indocyaningrün (ICG)-Farbstoff unterscheidet. Die subkutane Injektion von Au-PC ermöglicht die Kartierung von Lymphknoten mittels NIR-II-Fluoreszenzbildgebung zu einem optimalen Zeitpunkt von etwa 0,5 bis 1 Stunde nach der Injektion, gefolgt von einer schnellen renalen Clearance. Die präklinische NIR-II-Fluoreszenz-LN-Bildgebung mit Au-PC bietet ein hohes Signal-Hintergrund-Verhältnis sowie eine hohe Sicherheit und Biokompatibilität und ist vielversprechend für die zukünftige klinische Umsetzung.

Sentinel-Lymphknoten (SLN) sind die primären Tumordrainageknoten, in denen Krebsmetastasen zuerst auftreten. Die Tumorzellen breiten sich von den peritumoralen Lymphgefäßen zum SLN und dann zu entfernten Knoten aus, um die lymphatische Ausbreitung bösartiger Tumorzellen einzuleiten1. Die SLN-Biopsie (SLNB) ist eine Standardmethode zur Krebsstadieneinstufung und umfasst die peritumorale Verabreichung von Radioisotopen, Farbstofftracern oder einer Kombination aus beiden zur SLN-Identifizierung2. Dies geschieht durch die präoperative Verabreichung üblicher Tracer des Technetium-99m-Isotops (für die Lymphoszintigraphie), eines fluoreszierenden NIR-I-Farbstoffs (700–900 nm), Indocyaningrün (ICG)3,4,5,6,7 und Methylenblau (MB). 8,9 oder deren Kombination und Erkennung der Signale der zu den SLNs abgeleiteten Tracer. Die Einführung der Lymphoszintigraphie bei SLNB gilt bisher als „Goldstandard“ in der klinischen Onkologie zur Beurteilung und Einstufung von Brust-, Melanom- und Kopf- und Halskrebsmetastasen10,11,12. In klinischen Studien mit Szintigraphie in Verbindung mit SPECT/CT und intraoperativer Gabe eines sekundären visuellen blauen Farbstoffs wurden hohe SLN-Erkennungsraten erreicht. Die SLNs werden normalerweise innerhalb von 10–60 Minuten (manchmal mehreren Stunden) sichtbar gemacht, jedoch tragen mehrere Risikofaktoren zu einer Fehlerkennungsrate von 2–28 %13 bei. Zu den Nachteilen der Lymphoszintigraphie gehören entweder der Mangel an nuklearmedizinischen Einrichtungen oder der fehlende Zugang zu Radiopharmaka. Operationen mit radioaktiver Strahlung bergen gewisse Risiken für das medizinische Personal. Auch radiologische Verfahren sind für einige Patientengruppen (z. B. schwangere Frauen) grundsätzlich ausgeschlossen14. Stattdessen wird ICG als alternativer, billigerer und nicht minderwertiger Tracer zur Lymphoszintigraphie weithin für die LN-Bildgebung bei Brustkrebs, dermatologischen und onkologischen Krebsarten eingesetzt15. Die anschließende chirurgische Entfernung und pathologische Untersuchung der markierten Lymphknoten ermöglicht eine Beurteilung des Vorhandenseins und der möglichen Ausbreitung von Krebs und liefert Hinweise für eine ordnungsgemäße und effiziente Behandlung16.

Seit 200917 hat die In-vivo-Einphotonen-Fluoreszenzbildgebung biologischer Systeme im NIR-II-Fenster (1000–3000 nm) zur nicht-invasiven, hochauflösenden Echtzeitbildgebung biologischer Strukturen (einschließlich Lymphknoten) und Prozesse geführt auf der Ebene einzelner Zellen und einzelner Gefäße18,19,20,21,22 und ergänzt andere Bildgebungsmodalitäten, einschließlich Computer-Röntgentomographie (CT)23, Radio-Bildgebung24, fotoakustische Bildgebung25 und Magnetresonanztomographie (MRT)26. NIR-II-bildgesteuerte chirurgische Eingriffe/Exzisionen werden ebenfalls aktiv verfolgt27,28,29. Die Fluoreszenzbildgebung im NIR-II-Fenster profitiert von einer reduzierten Lichtstreuung durch Gewebe30 und unterdrückten Hintergrundsignalen der Gewebeautofluoreszenz31 und bietet eine höhere Empfindlichkeit sowie eine höhere zeitliche und räumliche Auflösung bei tieferen Eindringtiefen (sub-cm)18,19,20,21,22 als vorherige NIR-I-Bildgebung im Wellenlängenbereich von 800–900 nm. Eine Reihe organischer und anorganischer NIR-II-Sonden, wie Donor-Akzeptor-Farbstoffe32,33, Kohlenstoffnanoröhren (CNTs)18,34, Quantenpunkte (QDs)20,35 und Rear-Earth-Down-Conversion-Nanopartikel36,37, wurden eingesetzt für die NIR-II-Bildgebung von Blutgefäßen durch die Haut/Gewebe18,21,22,38 in Studien zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Schädel-Hirn-Trauma (TBI)19,39, molekulare Bildgebung von Krebserkrankungen36,40 und Beurteilung des Ansprechens auf eine Immuntherapie im Einzelfall -Zellniveau in vivo19,22. Die Bildgebung von Lymphknoten im NIR-II-Fenster wurde ebenfalls verfolgt33,35,41, es ist jedoch noch viel Arbeit erforderlich, um NIR-II-Sonden weiterzuentwickeln, um hohe LN/Hintergrund-Verhältnisse, einen genau definierten Zeitpunkt für die Sondenverabreichung/Bildgebung usw. zu erreichen Hohe Sicherheit und schnelle Freigabe.

Gold-Molekülcluster42,43,44,45 haben aufgrund ihrer molekularähnlichen Strukturen46 und der daraus resultierenden Eigenschaften47, ihrer hohen Stabilität48 und vor allem ihrer Sicherheit und Biokompatibilität49,50,51 großes Interesse auf sich gezogen. Mehrere Goldcluster zeigten Photolumineszenz, die über den UV-Vis-Bereich des Spektrums hinaus bis in den NIR-Bereich reichte52,53,54,55,56. Wasserlösliche Au25(GSH)18 (GSH: Glutathion)-Cluster, die im Bereich > 1000 nm emittieren, wurden für die Bildgebung durch den Schädelhirn und den Nachweis von Gehirnblutgefäßen in Lipopolysacchariden (LPS) verwendet, die in vivo Hirnverletzungen und Schlaganfälle verursachten52. Mit Glutathionliganden beschichtete Gold-Molekülcluster wurden auch für die NIR-II-Fluoreszenzbildgebung von Knochen eingesetzt, wobei die effiziente Au-GSH-Bindung an die Knochenmatrix genutzt wurde55. Anti-CD326-markierte56 und Folsäure-verkappte PEGylierte Au-Cluster, die mit Chlorin e6 (Ce6)-Photosensibilisator54 beladen waren, zeigten eine hervorragende Tumorpenetration und -retention in Xenotransplantat-MCF-7- und MGC-803-Tumormausmodellen sowie einen photodynamischen Therapieeffekt (PDT) mit Ce6-beladenen Clustern54. Trotz dieser Fortschritte wurde bisher wenig zur Lymphknotenbildgebung unter Verwendung von NIR-II-emittierenden Au-Molekülclustern unternommen.

Hier untersuchen wir NIR-II-fluoreszierende Goldmolekülcluster mit einer „Stealth“-Beschichtung für die Lymphknotenbildgebung. Wir synthetisieren Au-GSH-Molekülcluster in einer wässrigen Lösung und modifizieren dann Au-GSH durch kovalente Konjugation von GSH an 4-Aminophenylphosphorylcholin-Liganden (kurz p-APPC oder PC). Phosphorylcholin und Derivate sind in vitro und in vivo hoch biokompatibel57,58,59 und verleihen festen Oberflächen wie Graphenoxid-Dünnfilmen60 und planaren Goldoberflächen61 bekanntermaßen eine hohe Beständigkeit gegen unspezifische Proteinwechselwirkungen. Es wurde festgestellt, dass sich die resultierenden Au-PC-Cluster in vivo wie „Super-Stealth“-Sonden verhalten, ohne an Serumproteine ​​wie ICG zu binden oder eine unspezifische Knochenansammlung wie die übergeordneten Au-GSH-Cluster aufzuweisen, was die Abbildung von Mauslymphknoten innerhalb weniger Minuten ermöglicht intratumorale oder subkutane Injektion. Die Au-PC-Cluster zeigen eine geringe Retention an der Injektionsstelle, was sich von vielen Nanomaterialien unterscheidet, und erreichen innerhalb von 24 Stunden eine nahezu 100-prozentige renale Ausscheidung aus dem Körper. Wir glauben, dass die Au-PC-Molekülcluster vielversprechende Sonden für die NIR-II-Fluoreszenz-Lymphknotenbildgebung für den menschlichen Einsatz in der Klinik sein könnten.

Wir synthetisierten Au-GSH-Cluster (Abb. 1a) in der wässrigen Phase gemäß einer zuvor beschriebenen Methode62 und verknüpften die Cluster dann kovalent mit 4-Aminophenylphosphorylcholin (PC)-Liganden durch EDC/NHS-Chemie in einem MES-Puffer mit pH 7,0 und anschließender Reinigung um die Au-GSH-PC-Konjugate zu liefern (im Folgenden als Au-PC bezeichnet, Abb. 1b) (siehe Methoden). Die UV-Vis-Absorption der Probe zeigte einen abnehmenden Trend bei längeren Wellenlängen, der für die Au-SR-Cluster 62 (SR: Thiolligand) typisch ist (Abb. 1c). Die Konjugation des PC-Liganden an Au-GSH führte zum Auftreten einer Beule bei 250 nm (im Zusammenhang mit dem PC-Liganden, ergänzende Abbildung 1a) mit einem etwa 1,5 ± 0,1-fachen (oder 50 %) Anstieg der Absorption und einem geschätzten Anstieg von etwa 50 % Konjugationsausbeute (~18 PC-Liganden pro Cluster), ergänzende Abbildung 1b. Die Konjugation des PC-Liganden an die Clusteroberfläche wurde außerdem durch ATR-FTIR-Spektroskopie validiert (ergänzende Abbildung 2). Die charakteristischen asymmetrischen (1240 cm-1) und symmetrischen (1090 cm-1) Streckschwingungsmoden der PO2-Gruppe und der Cholin-Kopfgruppe bei 970–895 cm-1 können im Au-PC-Konjugat deutlich beobachtet werden. Das Verschwinden des Streckungsmodus bei 1600 cm−1, der auf die Anwesenheit von Natriumcarboxylat zurückzuführen ist, verschwand in Au-PC vollständig. Die detaillierte Zuordnung jedes Schwingungsmodus ist in der Ergänzungstabelle 1 angegeben. Die TEM-Bilder des Au-GSH-Clusters (Abb. 1d) und des Au-PC-Konjugats (Ergänzungstabelle 3), die mit einem Kryo-Elektronenmikroskop (Ergänzungstabelle 2) erhalten wurden, zeigen sphärische Partikel mit enger Größenverteilung mit einer durchschnittlichen Größe von 1,64 ± 0,24 nm (Abb. 1e) bzw. 1,65 ± 0,22 nm (ergänzende Abb. 3b). Unter einer 808-nm-Laseranregung zeigten die Au-Molekülcluster Photolumineszenz (PL) im NIR-II-Fenster, wobei der maximale Peak bei ~1090 nm lag (Abb. 1c), ähnlich wie in früheren Berichten52,55. Über 2 Stunden kontinuierlicher 808-nm-Laserbestrahlung mit einer Leistungsdichte von 35 mW/cm2 wurde nach einem anfänglichen Abfall von ~ 8 % über die Zeit eine stabile Lumineszenz beobachtet (ergänzende Abbildung 4a). Wir haben die Photolumineszenzstabilität (PL) von Au-GSH-Clustern und Au-PC in Wasser, PBS und FBS vor und nach zwei Wochen untersucht (ergänzende Abbildung 4b, c). Die PL-Intensität von Au-GSH und Au-PC stieg in PBS und FBS im Vergleich zu Wasser am Tag 0 leicht an, die entsprechenden Intensitäten waren jedoch um ~10–21 % für Au-GSH und ~17–19 % für Au-PC verringert nach einer Woche Inkubation. Nach zweiwöchiger Inkubation wurde kein weiterer Rückgang der Intensität beobachtet. Die absoluten NIR-II-Emissionsquantenausbeuten der bei 808 nm angeregten Au-GSH- und Au-PC-Cluster wurden im Emissionsbereich von 900–1500 nm unter Verwendung einer integrierten Kugeltechnik mit ~ 0,27 bzw. 0,38 % gemessen (siehe Methoden).

eine kristallographische Darstellung der Au25-Clusterstruktur. Farbcodes der Elemente: Au (0) im Kern: gelb, Au (I) im Grundmotiv: orange, S im Grundmotiv: grün. Die Struktur wurde mit dem UCSF Chimera-Programm (Version 1.12) auf der Grundlage der in Referenz 46 veröffentlichten Kristallstrukturdaten erstellt. b Postfunktionalisierung des Au-GSH-Clusters und schematische Darstellung der Au-PC-Konjugatstruktur. Der Übersichtlichkeit halber sind nur ein Klammermotiv und angrenzende Goldkernatome dargestellt. Der Einfachheit halber wird die Konjugation des PC-Liganden an die Glycin-Carboxylgruppe weggelassen und nur mit der funktionellen γ-Glutamat-Carboxylgruppe von GSH gezeigt. c UV-Vis-Absorptions- und Fluoreszenzspektren des Au-GSH-Clusters in wässriger Phase. d KryoEM-Aufnahme von Au-GSH-Clustern mit einer durchschnittlichen Größe von 1,64 nm ± 0,24 nm (n = 3). e Deskriptive statistische Analysen der Partikelgrößenverteilung von Au-GSH-Clustern, erhalten aus KryoEM-Mikroaufnahmen. f ESI-MS-Spektrum des Au-GSH-Clusters im negativen Ionenmodus von m/z 1000 bis 3000: Mehrere negativ geladene Spezies von 5–8 wurden identifiziert und die verbleibenden Peaks waren klein und wurden Verunreinigungsclustern/-spezies zugeschrieben. g ESI-MS-Spektren der Hauptpeaks 5–8 mit geschätzten Natriumaddukten wurden einer gemeinsamen Formel [Au25(GS)18 + xNa-xH-zH]z zugeordnet. au: beliebige Einheiten. Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Die synthetisierten Goldcluster waren molekularer Natur (sehr kleine Größe < 3 nm) ohne plasmonische Merkmale und im Durchschnitt als Au25-GSH charakterisiert (Abb. 1f, g), jedoch mit einem gewissen Grad an Inhomogenität62. Die Massenspektrometriemessung mit Elektrosprayionisation (ESI) identifizierte mehrere negativ geladene Spezies (Abb. 1f) mit Natriumaddukten und wurde der Gruppe [Au25(GS)18 + xNa-(xz)H]z- zugeordnet, wobei x die ist Anzahl der Natriumaddukte, z ist die Ladung (Abb. 1g).

In vitro beobachteten wir keine Zytotoxizität der übergeordneten Au-GSH- und Au-PC-Cluster, wenn 4T1-Brustkrebszellen der Maus und CT26-Dickdarmkrebszellen mit unterschiedlichen Massenkonzentrationen der Cluster bei 1 mg/ml, 5 mg/ml und inkubiert wurden 10 mg/ml-Konzentrationen für 12 Stunden bei 37 °C (ergänzende Abbildung 5). Dies ist nicht überraschend, da sowohl GSH- als auch PC-Liganden natürlich vorkommende Biomoleküle sind und Gold ein sicheres Element ist. GSH ist an der antioxidativen Abwehr gegen die Aktivität reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), am Nährstoffstoffwechsel und an zellulären Ereignissen beteiligt63, wohingegen der PC-Ligand ein Bestandteil der Zellmembran ist.

Wir haben die Serumproteinbindungsfähigkeiten des Au-GSH-Clusters und des Au-PC-Konjugats mit FBS bewertet und mit denen von ICG verglichen. Kurz gesagt, die Cluster und ICG wurden 1 Stunde lang bei 37 ° C mit FBS inkubiert (ergänzende Abbildung 6). Anschließend wurden die Lösungen mit Amicon 50 kDa-Zentrifugenfiltern filtriert (ergänzende Abbildung 6a, b). An Serumproteine ​​gebundene Au-Cluster passieren den Filter nicht, während freie, ungebundene Cluster im Filtrat verloren gehen. Die optische Dichte (OD) von Filtrat (im Fall von Au-GSH und Au-PC) und Retentat (im Fall von ICG) bei 808 nm wurde gemessen und die entsprechenden Serumproteinbindungseffizienzen berechnet (ergänzende Abbildung 6c). Die Schemata der Experimente, Abbildungen und Absorptionswerte von Au-GSH + FBS- und Au-PC + FBS-Filtraten sowie ICG + FBS-Retentat finden Sie in der ergänzenden Abbildung 6. Die Serumproteinbindungseffizienzen für Au-GSH-Cluster , Au-PC-Konjugat und ICG wurden mit 2,7 %, 1,74 % bzw. 94,5 % berechnet. Das heißt, dass sich das meiste 94,5-prozentige ICG an Serumprotein bindet und den Filter nicht passiert. Während sowohl Au-GSH als auch Au-PC eine viel geringere Wechselwirkung mit Serumproteinen, insbesondere Au-PC, zeigten.

In vivo wurden die in PBS gelösten Au-GSH- und Au-PC-Cluster zunächst intravenös (iv) an Mäuse (5–7 Wochen alte weibliche Balb/c, n = 3 in jeder Gruppe) durch Schwanzveneninjektion verabreicht, abgebildet in im NIR-II-Fenster >1100 nm gemessen und Seite an Seite mit dem klinisch zugelassenen ICG-Farbstoff verglichen. Die NIR-II-Signale der Blase bei Mäusen leuchteten ca. 3 Minuten nach der Injektion (pi) schnell auf (Abb. 2a, b, ventrale Ansicht), als Folge der Nierendrainage für eine schnelle renale Clearance (Bilder der dorsalen/lateralen Ansicht in den ergänzenden Abbildungen). 7a bzw. 8a). Es wurde gezeigt, dass ICG einen Fluoreszenzschweif aufweist, der sich bis zum >1000 nm NIR-II-Fenster erstreckt64. Bei intravenös injiziertem ICG wurden starke NIR-II-Signale in Leber und Darm beobachtet, was mit dem biliären Ausscheidungsweg in Form von ICG-Serumprotein-Bindungskomplexen übereinstimmt65 (Abb. 2c). Das Körpersignal wurde 24 Stunden nach der Injektion gelöscht, ohne dass eine signifikante ICG-Retention in den Hauptorganen auftrat (ergänzende Abbildung 9).

Weitfeld-NIR-II-Fluoreszenzbilder (angeregt durch einen 808-nm-Laser mit einer Leistungsdichte von 70 mW/cm2, Belichtungszeiten 40 ms bzw. 4 ms für Au und ICG, 1100-nm-Langpassfilter) von intravenös (iv) injizierten ein Au-PC-Konjugat (4x, ~ 1,2 mg), b Au-GSH-Cluster (4x, ~1,2 mg) und (c) ICG-Sonden (50 µL, 50 mM) zu verschiedenen Zeitpunkten (sechs bis sieben Wochen altes Weibchen). Balb/c, n = 3). Bioverteilung in wichtigen Organen 24 Stunden nach der Injektion von d-Au-PC- und e-Au-GSH-Fluoreszenzsonden. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) von drei wiederholten Experimenten dar. Balkendiagrammdaten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. f Mikroanatomie histologischer Schnitte von mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Hauptorganen von gesunden Mäusen und Mäusen, denen 24 Stunden nach der Injektion Au-PC-Konjugat injiziert wurde (20-faches Objektiv, Maßstabsbalken ist 100 µm). Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Die intravenös verabreichten Au-GSH-Cluster zeigten ein gewisses Maß an unspezifischer Akkumulation/Retention im zentralen Skelettsystem (insbesondere Rückenmark und Gelenke, ergänzende Abbildung 8c)55. ICP-MS-Analysen zeigten, dass etwa 64 % des iv injizierten Au-GSH innerhalb von 1 Stunde pi mit dem Urin ausgeschieden wurden und eine Gesamtausscheidung von etwa 73 % an einem Tag erreichte, wobei etwa 1 % des Goldes in der Leber und 0,35 % in den Nieren verblieben (Abb. 2e und ergänzende Abb. 8b). Bei Au-PC beobachteten wir solche Knochensignale nicht mehr und das Au-PC wurde frei mit dem Urin ausgeschieden, ohne dass es in wichtigen Organen zurückgehalten wurde, was auf eine stark verdeckte Natur der Au-PC-Cluster (ergänzende Abbildung 7c) ohne Bindung an Serumproteine ​​hindeutet. Wir beobachteten, dass ~ 81 % des Au-PC innerhalb von 1 Stunde pi im Urin ausgeschieden wurden und nach 24 Stunden pi weiter auf ~ 93 % anstiegen (Abb. 2d und ergänzende Abb. 7b). Die Au-PC-Cluster sind äußerst unauffällig und weisen kaum unspezifische Wechselwirkungen mit Proteinen und anderen biologischen Spezies auf, was wahrscheinlich auf zwei Faktoren zurückzuführen ist, die zuvor durch Experimente und Simulationen für Alkylthiol-PC-Monoschichten auf Gold aufgeklärt wurden66. Das erste ist die starke Wasserhydratisierung der zwitterionischen PC-Gruppe durch Wassermoleküle durch elektrostatische Kräfte und das zweite sind minimale Netto-Dipolmomente der PC-Kopfgruppen, die antiparallel nahezu senkrecht zur Au-Oberfläche ausgerichtet sind66. Beide Faktoren trugen wahrscheinlich zu minimalen unspezifischen Wechselwirkungen zwischen Au-PC und Proteinen bei.

Histologische Schnitte von mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Hauptorganen einer unbehandelten Maus und einer mit Au-PC-Konjugat injizierten Maus zeigen keine Unterschiede (Abb. 2f), was auf eine hohe Sicherheit intravenös injizierter Au-PC-Sonden in vivo schließen lässt.

Für die Lymphknotenbildgebung führten wir eine Intra-Tumor-/Peritumor-Verabreichung (it) von Au-PC-Clustern an Mäuse (5–7 Wochen alte weibliche Balb/c, n = 3 in jeder Gruppe) durch, die syngene 4T1-Mäuse-Brusttumoren trugen ( Ergänzende Videos 1–3, In-situ-Sondenverabreichung und Echtzeit-NIR-II-In-vivo-Bildgebung des entwässernden Lymphknotens) und CT26-Dickdarmtumoren, die an den Hinterbeinen inokuliert wurden (Ergänzungsvideos 4, 5, In-situ-Sondenverabreichung und Echtzeit-NIR-II In-vivo-Bildgebung des entwässernden Lymphknotens). Mehrere Dosen von Au-PC-Sonden, darunter 4x (~1,2 mg, Tumoren an beiden Hinterbeinen, Zusatzvideo 1), 1x (~300 μg, Tumor am rechten Hinterbein, Zusatzvideo 2) und 1/3x (~ 100 μg, Tumor am rechten Hinterbein, Zusatzvideo 3) verabreicht (Abb. 3a, Ergänzende Abb. 10, 11). Die drainierenden inguinalen Lymphknoten (iLN) begannen innerhalb von ~1 Minute pi eine NIR-II-Emission von Au-PC zu zeigen und erreichten innerhalb von ~3 Minuten pi eine hohe Helligkeit (Abb. 3a, ergänzende Abb. 11 für 4T1; ergänzende Abb. 12a für CT26-Tumor). Das LN-Signal blieb über 1 Stunde in den entleerenden iLNs bestehen (Abb. 3a), nachdem es bei ~ 30 min pi die Spitzenintensität erreicht hatte, mit einem LN/Hintergrundsignal-Verhältnis ~ 5–10 (Abb. 3d, ergänzende Abb. 12d). In 10 Minuten pi beobachteten wir eine Au-PC-NIR-II-Emission im Lymphgefäß von iLNs, die bis zur Achselregion reichte, und markierten die axilläre LN (aLN) sowohl für 4T1- als auch für CT26-Mausmodelle schwach (ergänzende Abbildung 13a, b). . Das Signal verschwand nach 30 Minuten pi der Au-PC-Sonde vollständig. Die Au-PC-Cluster ermöglichten eine schnelle und effektive Bildgebung/Erkennung der LNs der primären Schicht mit viel schwächeren Signalen in Knoten der höheren Schicht.

Weitfeld-NIR-II-Fluoreszenzbilder (angeregt durch einen 808-nm-Laser mit einer Leistungsdichte von 70 mW/cm2, Belichtungszeiten 20, 40 ms und 4 ms für Au-PC, Au-GSH und ICG, jeweils 1100 nm lang). Passfilter) von (peri)intra-tumoralem (it) injizierte ein Au-PC-Konjugat (1x, ~ 300 µg), b Au-GSH-Cluster (1x, ~ 300 µg) und c ICG-Sonden (50 µL, 50 mM). in eine Maus, die zu verschiedenen Zeitpunkten 4T1-Tumoren an den Hinterbeinen trug (sechs bis sieben Wochen altes weibliches Balb/c, n=3). Normalisierte Fluoreszenzintensitäten (linke Y-Achsen) und Lymphknoten-Signal-Hintergrund-Verhältnisse (LN/B) (rechte Y-Achsen) von inguinalen Lymphknoten (iLNs) bis zu sechs Stunden nach der Injektion von d Au-PC-Konjugat, e Au-GSH Cluster und f ICG-Fluoreszenzsonden. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) von drei wiederholten Experimenten dar. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Zum Vergleich mit Au-PC führten wir die Verabreichung von Au-GSH-Sonden in 4T1-Tumoren durch (5–7 Wochen alte weibliche Balb/c, n = 3 in jeder Gruppe) (Abb. 3b und ergänzende Abb. 12c rechte Seitenansicht, Ergänzende Videos 6, 7, In-situ-Sondenverabreichung und Echtzeit-NIR-II-In-vivo-Bildgebung von Drainage-Lymphknoten) und CT26-Tumoren (Ergänzende Abb. 12b, Ergänzende Videos 8, 9, In-situ-Sondenverabreichung und Echtzeit-NIR- II In-vivo-Bildgebung des Drainage-Lymphknotens) und beobachtete eine viel kürzere Zeitspanne für den LN-Drainageprozess. Die in LNs nach 1x (Abb. 3b, e) und 4x (ergänzende Abb. 12b, c) dosierter Verabreichung von Au-GSH festgestellten NIR-II-Signale waren relativ niedrig und unterschieden sich nicht signifikant in der Intensität. Die Signale in den iLNs erreichten ihre maximale Intensität schnell nach ~ 10 min pi mit LN/Hintergrund (LN/B)-Signalverhältnissen von ~ 2–4 (Abb. 3e und ergänzende Abb. 12f) für 4T1-Tumoren und ~ 6–7 ( Ergänzende Abbildung 12e) für CT26-Tumoren und schnell aus dem Lymphsystem entfernt. Ebenso wurden sehr schwache aLNs nachgewiesen (ergänzende Abbildung 13c). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Au-GSH ein weniger ideales LN-Bildgebungsmittel ist als Au-PC, da letzteres das LN über einen längeren Zeitraum von ~ 1 Stunde nach der Injektion viel heller beleuchtet.

Ergänzende Abbildungen. 14, 15 zeigen NIR-II-Fluoreszenzsignale in wichtigen Organen zum Zeitpunkt der höchsten Lymphknotenentleerung, d. h. 10 min pi für Au-GSH und 30 min pi für Au-PC, nach intratumoraler Verabreichung von 1x Au-GSH und Au- PC-Sonden. Im Vergleich zu NIR-II-Signalen in iLNs 10 Minuten nach der Verabreichung der Au-GSH-Sonde wurden nach 30 Minuten pi des Au-PC-Konjugats etwa 3–5-fach höhere LN-Signale beobachtet (ergänzende Abbildung 16).

Im Vergleich zu Au-PC- und Au-GSH-Sonden beobachteten wir, dass ICG eine drastisch unterschiedliche SLN-Drainagekinetik aufwies (Abb. 3c, Zusatzvideos 10, 11, In-situ-Sondenverabreichung und Echtzeit-NIR-II-In-vivo-Bildgebung der Drainagelymphe). Knoten, 5–7 Wochen altes weibliches Balb/c, n = 3). Die Zeiten, in denen das ICG-Signal zum ersten Mal im SLN auftrat, waren länger als die von Au-PC und Au-GSH und variierten von Maus zu Maus im Bereich von 10 bis 30 Minuten nach der Injektion in den 4T1-Tumor. Es ist bekannt, dass ICG6,7 an Serumproteine ​​bindet und so die Kinetik des SLN-Abflusses verlangsamt. Das Signal im Lymphknoten nahm allmählich zu und erreichte 2–3 Stunden nach der Injektion seine Spitzenintensität mit LN/B-Verhältnissen von ~4 (Abb. 3f). Dies stand im Einklang mit klinischen Studien, in denen festgestellt wurde, dass der Zeitpunkt für die Anzeige des ICG-Fluoreszenzsignals in den Sentinel-Lymphknoten bestimmter Krebsarten (z. B. Mundkrebs) unterschiedlich war, was zu Unsicherheiten beim Zeitpunkt zwischen Injektion und Bildgebung/Operation führte und zwischen 15 und 15 Minuten lag bis zu 24 Stunden6,16. Bei der Bildgebung im Laufe der Zeit wurden in einigen Fällen zusätzlich zum dLN der ersten Schicht auch höherstufige Lymphknoten beobachtet. In dieser Hinsicht unterschieden sich die Au-PC-Cluster erheblich, da sie kaum mit Proteinen und Zellen interagierten, ungehindert durch die Lymphgefäße transportiert wurden und eine dLN-Bildgebung in angenehm großen Zeitfenstern von Minuten bis etwa 1 Stunde nach der Injektion mit geringer zeitlicher Unsicherheit ermöglichten.

Ähnlich wie bei den intravenösen Injektionen wurden die intratumoral injizierten Au-PC- und Au-GSH-Sonden über die Niere aus dem Körper ausgeschieden (Abb. 4), wohingegen ICG über das Ausscheidungssystem der Leber ausgeschieden wurde. Innerhalb von 24 Stunden zeigte die ICP-MS-Analyse der Ausscheidungen, dass etwa 92 % der injizierten Au-PC-Probe über den Urin ausgeschieden wurden (Abb. 4a, b), während mit Au-GSH nur 38 % der Urinausscheidung beobachtet wurden (Abb. 4c, D). Für die Au-PC-Sonde wurde 24 h pi ein nahezu vollständiges Signalverschwinden von der Tumorinjektionsstelle und vom Mauskörper beobachtet (Abb. 3a), und gleichzeitig wurden an den Tumorinjektionsstellen für Au-GSH immer noch signifikante Signale festgestellt (Abb. 3b) und ICG-Sonden (Abb. 3c). Die Au-PC-Cluster zeigten im Vergleich zu ICG und Au-GSH die geringste Einbindung und Retention an der Injektionsstelle und im Körper, was darauf hindeutet, dass die Au-Cluster aufgrund der Oberflächen-Phosphocholinliganden, die für minimale Wechselwirkungen und unspezifische Bindung sorgen, sehr verborgen sind mit Proteinen, Zellen und Geweben/Organen im Körper.

a, c Profile der schnellen renalen Ausscheidung (a bis zu 24 h pi) und b, d Bioverteilung in wichtigen Organen nach 48 h intratumoraler (it) Verabreichung von Au-PC- und Au-GSH-Fluoreszenzsonden an eine Maus mit 4T1-Tumoren an den Hinterbeinen (n = 3). Die Einschübe in a und c stellen NIR-II-Fluoreszenzbilder (angeregt durch einen 808-nm-Laser mit einer Leistungsdichte von 70 mW/cm2, Belichtungszeit 40 ms, 1100-nm-Langpassfilter) von gesammelten Urinproben zu verschiedenen Zeitpunkten für Au dar -PC bzw. Au-GSH. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) von drei wiederholten Experimenten dar. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes untersuchten wir die LN-Drainage nach subkutaner (sc) Injektion der drei Sonden an der Schwanzbasis der Maus (Abb. 5) (5–7 Wochen altes weibliches Balb/c, n = 3 in jeder Gruppe). Die Au-PC-Cluster wanderten innerhalb von 3 Minuten pi zu den Lymphgefäßen, die die Injektionsstelle mit dem ableitenden iLN verbinden (Abb. 5a und ergänzende Abb. 17). Starke Signale im iLN wurden bis zu 1 Stunde beobachtet und nahmen 2 Stunden pi um ~40 % ab (Abb. 5d). Innerhalb von 24 Stunden verschwanden die Au-PC-Signale mit geringer Retention an der Injektionsstelle aus dem Körper (ergänzende Abbildung 17). Im Fall von sc-injizierten Au-GSH-Clustern erreichte das Signal im iLN nach 30 Minuten seinen Höhepunkt, nahm 2 Stunden pi um ~50 % ab und verschwand nach 24 Stunden größtenteils von der Injektionsstelle, im zentralen Skelettgerüst wurde jedoch ein signifikantes Signal beobachtet (Abb. 5b, e und ergänzende Abb. 18). Innerhalb von 24 Stunden zeigte die ICP-MS-Analyse, dass etwa 92 % der injizierten Au-PC-Probe über den Urin ausgeschieden wurden (ergänzende Abbildung 19a, b), während mit Au-GSH eine Ausscheidung von etwa 71 % im Urin beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 19c, D). Im Gegensatz dazu erschien das Fluoreszenzsignal in iLN nach ICG-Verabreichung (Abb. 5c) 3 Minuten pi, jedoch mit einer viel geringeren Intensität im Vergleich zu der der Au-PC-Sonde zum gleichen Zeitpunkt nach der Injektion (Abb. 5f). Nach 2–3 Stunden pi (oder sogar später) erreichte das ICG-Signal im iLN seinen Höhepunkt und blieb bestehen. Selbst nach 24 Stunden pi blieb noch ein signifikantes Signal im Lymphknoten, an der Injektionsstelle und in der Leber (Abb. 5f und ergänzende Abb. 20). Die Retention von ICG an der Injektionsstelle hielt über einen längeren Zeitraum an (Abb. 5F), viel länger als bei Au-PC. Die Au-PC-Molekülcluster waren auch unter verschiedenen Nanomaterialien (mit gut beschichteten hydrophilen Schichten wie PEG), einschließlich Quantenpunkten (QDs), Kohlenstoffnanoröhren (CNTs) und organischen NIR II-Farbstoffen, einzigartig und verfügten nur über eine geringe Retention an subkutanen Injektionsstellen67,68. Das Einfangen von NIR-II-Sonden an der Injektionsstelle und deren wochenlange Färbung ist aufgrund möglicher langfristiger Nebenwirkungen unerwünscht.

Weitfeld-NIR-II-Fluoreszenzbilder (angeregt durch einen 808-nm-Laser mit einer Leistungsdichte von 70 mW/cm2, Belichtungszeiten 100 ms bzw. 4 ms für Au und ICG, 1100-nm-Langpassfilter) von bilateralen subkutanen (sc ) injizierte ein Au-PC-Konjugat (4x, ~ 1,2 mg), b Au-GSH-Cluster (4x, ~ 1,2 mg) und c ICG-Sonden (50 µL, 50 mM) zu verschiedenen Zeitpunkten (sechs bis sieben Wochen alte weibliche Balb /c, n=3). Normalisierte Fluoreszenzintensitäten (linke Y-Achsen) der rechten (R) inguinalen Lymphknoten (iLNs) bis zu sechs Stunden nach der Injektion und Region of Interest-Signal (ROI, rechte Y-Achsen) um die Injektionsstelle bis zu 24 Stunden nach der Injektion von Au- PC (d), Au-GSH (e) und ICG (f) Fluoreszenzsonden. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) von drei wiederholten Experimenten dar. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir haben auch Langzeitstudien zum Schicksal nach systematischer intravenöser (iv) und subkutaner (sc) Verabreichung von Au-GSH-Clustern (1x, ~ 300 µg, ergänzende Abbildungen 21, 23) und Au-PC-Konjugat (1x, ~ 300) durchgeführt µg, ergänzende Abbildungen 22, 24) an Mäuse wöchentlich (ab drei Wochen altem weiblichen Balb/c, n = 3 in jeder Gruppe). Die NIR-II-Bilder zeigen eine schnelle renale Clearance und LN-Drainage nach Verabreichung von Sonden. Die Diagramme der Körpergewichtszunahme im Vergleich zur Zeit zeigen einen stetigen Anstieg, der einem ähnlichen Trend folgt wie bei der Kontrollgruppe, die nur mit Kochsalzlösung behandelt wurde (ergänzende Abbildung 25). Komplette Blutbildanalysen (CBC) von Blutproben, die am Tag 48 (iv) und 47 (sc) entnommen wurden, zeigen keine offensichtlichen toxischen Wirkungen (ergänzende Abbildung 26). Die erhaltenen Ergebnisse waren mit denen der Kontrollgruppe vergleichbar, während geringfügige Abweichungen auf in den Probenröhrchen vorhandene Gerinnsel zurückzuführen waren. Die Morphologie der roten Blutkörperchen blieb normal. Die pathologische Untersuchung histologischer Schnitte von mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Organen zeigt keine Schädigung auf Gewebeebene (ergänzende Abbildung 27).

Zuletzt führten wir eine intratumorale Injektion einer 1-fachen Dosis Au-PC (Abb. 6a) und ICG (Abb. 6b) durch (5–7 Wochen alte weibliche Balb/c, n = 3 in jeder Gruppe) und verglichen die LN-Bildgebung durch NIR-Erkennung -II-Emission der Sonden (unter derselben 808-nm-Anregung) bei zunehmenden Wellenlängen im abfließenden iLN zum jeweiligen Zeitpunkt der Spitzenintensität. Wir analysierten die volle Halbwertsbreite (FWHM) für die Au-PC- und ICG-basierte LN-Bildgebung bei Emissionsfenstern von > 900 nm, > 1100 nm, > 1200 nm und > 1300 nm (Abb. 6C). Mit zunehmender Emissionswellenlänge verringerte sich offensichtlich die Verbreiterung der Querschnittsprofile und die gemessene Halbwertsbreite (FWHM) der Lymphknoten verringerte sich von 3,8, 3,5, 3,2 auf 2,8 mm (Abb. 6c), was auf eine höhere Bildauflösung schließen lässt bei längerer Emission. Die LN/B-Verhältnisse stiegen ebenfalls an und führten zu einem höheren LN/B-Verhältnis für Au-PC, insbesondere im Bildgebungsbereich > 1300 nm (Abb. 6d). Das bei > 1300 nm Emission für Au-PC gemessene LN/B-Verhältnis erreichte ~ 22 (Abb. 6d), was eine klare Identifizierung/Abbildung des primären Knotens ermöglicht.

Weitfeld-Fluoreszenzbilder (angeregt durch einen 808-nm-Laser mit einer Leistungsdichte von 70 mW/cm2) von intratumoral injiziertem 1x Au-PC-Konjugat und b ICG-Sonden in eine Maus mit 4T1-Tumor (sechs Wochen alt). weiblich Balb/c, n=3). Die Bilder zeigen die rechte Seitenansicht, aufgenommen 30 min pi und 3 h pi für Au-PC bzw. ICG bei verschiedenen NIR-I- und NIR-II-Fenstern. Die Belichtungszeiten für die Detektion von Emission > 900 nm, > 1100 nm, > 1200 nm und > 1300 nm betrugen 25 ms, 20 ms, 90 ms und 400 ms für Au-PC und 0,4 ms, 3 ms, 15 ms, 100 ms für ICG bzw. c Fluoreszenzintensitäts-Querschnittsprofil von iLN nach Au-PC-Verabreichung. Die Positionen des LN-Signals und des Hintergrunds (B) auf den Linienprofilen sind mit Pfeilen markiert. (d) Der Vergleich der Lymphknoten-Signal-Hintergrund-Verhältnisse (LN/B) des rechten (R) inguinalen Lymphknotens (iLNs) bei verschiedenen NIR-I- und NIR-II-Unterfenstern. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von drei wiederholten Experimenten dar. Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Der Nachweis und die genaue Identifizierung von Sentinel-Lymphknoten (SLN), gefolgt von einer Sentinel-Lymphknoten-Biopsie, ist für das Krebsstadium, die Metastasierungsbeurteilung und die weitere Behandlung in der klinischen Praxis von größter Bedeutung33,69. Obwohl mehrere NIR-I-Farbstoffe, darunter das klinisch zugelassene ICG4,16 und Methylenblau8,9, umfassend als potenzielle Fluoreszenz-Tracer für verschiedene Krebsarten untersucht wurden, wurde nach einem neuartigen Fluoreszenzfarbstoff gesucht, der eine hohe Fähigkeit zur LN-Markierung mit schneller Clearance und weniger Nebenwirkungen bietet vivo ist immer noch wünschenswert. ICG wird in der Klinik seit vielen Jahren für die SLN-Bildgebung und -Biopsie eingesetzt und weist eine Erfolgsbilanz hinsichtlich der hohen Effizienz, Biokompatibilität und Sicherheit der SLN-Bildgebung/-Identifizierung auf. Allerdings traten bei einem kleinen Prozentsatz der Patienten (<0,34 %)70 Nebenwirkungen auf, die wahrscheinlich auf Reaktionen von ICG mit Zellen/Geweben im Körper zurückzuführen waren. Ein weiteres Phänomen, über das bei der ICG-LN-Bildgebung berichtet wurde, war der variable Zeitpunkt des ICG-Signalpeaks in den Drainage-Lymphknoten, was zu Unsicherheiten hinsichtlich des optimalen Zeitpunkts für Bildgebung und Operation führte6,16.

Hier untersuchten wir molekulare Goldnanocluster mit NIR-II-Fluoreszenz für den SLN-Nachweis und die Kartierung in syngenen 4T1-Mausbrust- und CT26-Tumor-Mausmodellen. Die Eintopfsynthese in einer wässrigen Lösung ergab L-Glutathion-beschichtete Au-Cluster und die weitere Funktionalisierung mit dem Phosphorylcholin-Liganden (Au-PC) führte zu einer hoch biokompatiblen „Stealth“-NIR-II-Sonde. Die Quantenausbeute (QY) der Au-PC-NIR-II-Emission betrug ~0,38 %, was nicht hoch, aber ausreichend war, um bei intratumoraler Injektion mit einer Injektionsdosis von 0,3–1,2 mg (pro Tumor, durchschnittlich) helle LN-Signale zu erzeugen Tumorgröße ~15 cm3) für die Bildgebung unter einer sicheren Anregung mit 70 mW/cm2 und 808 nm und einer Bildaufnahmezeit von 20–40 ms. Der Mechanismus der NIR-Photolumineszenz/Fluoreszenz von Au-Molekülclustern ist komplex und wird immer noch diskutiert71. Für Au25-Cluster wurde gezeigt, dass die NIR-Emission hauptsächlich von ihrem ikosaedrischen Au13-Kern stammt72. Es wurde festgestellt, dass die inhärente Struktursteifigkeit73 oder Oberflächensteifigkeit mit Tetraoctylammonium (TOA)-Kationen74 und das Vorhandensein von „Verschlussringen“ und „Verriegelungsatomen“ in Clustern75 die Quanteneffizienz der NIR-Lumineszenz in thiolierten Goldclustern stark beeinflussen. Unsere aktuelle Synthese produzierte hauptsächlich Au25, enthält aber bekanntermaßen auch geringe Mengen anderer Cluster76. Es sollte noch Raum für eine Verbesserung der Synthese zur Herstellung von ~100 % Au-Molekülclustern, zum Verständnis des Fluoreszenzmechanismus und zum Design der optimalen Au-Cluster mit höherer Quantenausbeute geben.

Aufgrund des Phosphocholin-Liganden als in lebenden Systemen heimisches Sicherheitsbiomolekül sind die Au-PC-Molekülcluster einzigartig, da sie in vivo ein „Super-Stealth“-Verhalten mit vernachlässigbaren Wechselwirkungen/Bindungen mit Proteinen, Zellen und Geweben zeigen und über den Urin ausgeschieden werden geringe Retention in wichtigen Organen oder an den Injektionsstellen, unabhängig vom Injektionsweg (intravenös, intratumor oder subkutan). Das it- und sc-injizierte Au-PC wanderte schnell und unvermindert innerhalb von Minuten bis Stunden zu den entwässernden Lymphknoten. Dies unterschied sich stark von den meisten Nanomaterialien (Nanoröhren, QDs usw., selbst bei solchen mit stark wässrigen, stabilen Beschichtungen wie PEG-Polymeren), die dazu neigen, Tage oder sogar Monate an Injektionsstellen zu verbleiben77. Die Au-GSH-Sonden zeigten auch in vivo Stealth-Eigenschaften, zeigten jedoch ein gewisses Maß an unspezifischer Akkumulation im zentralen Skelettgerüst55, und der LN-Entleerungszeitraum schien viel kürzer mit niedrigeren LN-Signalen zu sein als im Fall von Au-PC.

Die LN-Drainage-Pharmakokinetik von Au-PC nach intratumoraler Verabreichung an Mäuse mit 4T1-Tumoren und CT26-Tumoren erreichte die drainierenden Leistenlymphknoten in ca. 1 Minute und blieb 30 Minuten bis 1 Stunde lang auf höchster Intensität, wobei sie zu späteren Zeitpunkten allmählich nachließ . Die Au-PC-Sonden ermöglichten die Drainage der LN-Bildgebung fast unmittelbar nach der Injektion und stellten ein Bildgebungsfenster von ca. 1–2 Stunden bereit. Dies könnte in klinischen Situationen nützlich sein, in denen schnelle Diagnosen und Interventionsentscheidungen erforderlich sind, und um Schwankungen im Bildgebungszeitpunkt zu vermeiden, wie sie bei ICG16 berichtet werden. Es wird möglich sein, alle SLNs kurz nach der Injektion von Au-PC während einer Operation abzubilden und nicht stundenlang warten zu müssen, bis der optimale Zeitpunkt erreicht ist. Die vernachlässigbare Wechselwirkung/Bindung von Au-PC mit dem Körper und der renalen Ausscheidung könnte auch die verbleibende Wahrscheinlichkeit unerwünschter Nebenwirkungen von ICG beseitigen70.

Sowohl Au-PC als auch ICG zeigen NIR-II-Fluoreszenz im Bereich von 1000–1400 mit geringen Emissionsschwänzen >1300 nm. Die Bildgebung im Bereich >1300 nm ist hinsichtlich Eindringtiefe, Signal/Hintergrund und Bildschärfe optimal, erfordert jedoch längere Belichtungszeiten (~400 ms). Das LN/Hintergrundsignal-Verhältnis, gemessen bei einer Emission von >1300 nm für Au-PC, lag bei ~22, was eine klare Identifizierung des abfließenden LN ermöglichte. Wir fanden heraus, dass ICG zwar auch eine nützliche Emission > 1300 nm aufwies, wir jedoch nicht immer ein so hohes LN/Hintergrundsignal wie Au-PC beobachteten, was durch diffuse Signale in der Nähe der Tumorinjektionsstelle verursacht wurde (Abb. 6b). Bei bildgestützten chirurgischen Eingriffen wurde festgestellt, dass kleine Cyaninfarbstoffe wie ICG eine Tendenz zur unspezifischen Diffusion und Bindung an Biomoleküle zeigten, was zu einem allgemeinen Signalhintergrund führte78. Dies wurde durch die hohen Hintergrundsignale im Fall der ICG-IT-Injektion bestätigt (Abb. 3c und 6b). Die Au-Cluster (sowohl Au-PC als auch Au-GSH) waren frei von einem solchen diffusiven und unspezifischen Bindungsverhalten, was eine schärfere und gezieltere Abbildung der dLNs ermöglichte. Diese wichtige Eigenschaft unterscheidet molekulare Au-Cluster von Cyaninfarbstoffen und soll laut Berichten die Auswanderung von Clustern aus normalen Blutgefäßen verlangsamen und ihre gezielte Wirkung auf Krebsgewebe verbessern44.

Wasserstofftetrachloraurat(III)-trihydrat (Sigma-Aldrich, ≥99,9 % Spurenmetallbasis), L-Glutathion reduziert (GSH, Sigma-Aldrich, ≥98,0 %), Natriumborhydrid (Sigma-Aldrich, ≥96 %), 1-( 3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC), N-Hydroxysuccinimid (NHS, Thermo Scientific) und 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (Tris-Base) wurden wie erhalten verwendet. DI-Wasser und Indocyaningrün (ICG) wurden von Fisher Scientific bezogen. 4-Aminophenylphosphorylcholin (PC) wurde von Santa Cruz Biotechnology Inc. gekauft.

In einer typischen Synthese62 wurden 5 mg HAuCl4·3H2O (0,013 mmol, 1,3 mM, Abwiegen mit einem Glasspatel) in 10 ml entionisiertem Wasser in einem Glasrundkolben gelöst und mit 16 mg reduziertem L-Glutathion (0,052 mmol) gemischt , 5,2 mM, in 10 ml entionisiertem Wasser), was zur Bildung einer leicht milchigen Lösung führt. Die Lösung wurde einige Minuten lang kräftig gerührt und dann nach Reduktion des intermediären GSH-Au(I)-Komplexes mit 5 mg frisch zubereiteter Natriumborhydridlösung (0,13 mmol, 13 mM) in 10 ml Wasser sofort eine leicht milchig-weiße Lösung erhalten wurde dunkelbraun, was auf die Bildung verschiedener nanoskaliger Cluster mit der gemeinsamen Formel Aun(GS)mq hinweist, wobei n die Anzahl der Goldatome im Cluster, m die Anzahl der Glutathionliganden und q die Nettoladung von ist der Cluster. Das kontinuierliche Ätzen der Reaktionsmischung über 24 Stunden bei Raumtemperatur führte zur Bildung des Endprodukts, nämlich Au25(GS)18. Die Reinigung der Probe wurde durch fünf- bis sechsmalige Zentrifugation (4400 U/min) unter Verwendung von 15 ml Amicon 3 K-Filtern und Wasser abgeschlossen. Die konzentrierte Lösung wurde zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert (bezeichnet als Au-GSH).

Die Oberflächenmodifikation des Clusters durch PC-Liganden wurde mithilfe der EDC/NHS-Chemie durchgeführt. Kurz gesagt, wurden ~ 36 Äquivalente (der theoretischen Anzahl von -COOH-Gruppen im Cluster) des 4-Aminophenylphosphorylcholin-Liganden zum Au-GSH-Cluster (1x, 300 µg) in MES-Puffer mit pH 7,0 gegeben, gefolgt von der Zugabe von 100 mM EDC und NHS. Die Konjugation wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler durchgeführt und anschließend wurden die verbleibenden Carboxylgruppen von GSH durch Zugabe von 100 mM TRIS blockiert und eine weitere Stunde lang reagieren gelassen. Das endgültige Au-GSH-PC-Konjugat (im Folgenden: Au-PC) wurde einige Male mit PBS-Puffer pH 7,4 unter Verwendung von Amicon 3KDa-Zentrifugenfiltern gewaschen und dann zur weiteren Verwendung im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt.

UV-Vis-Spektren wurden mit einem Varian Cary 6000i UV/Vis/NIR-Spektrophotometer unter Verwendung einer Quarzküvette mit einer Schichtdicke von 2 mm aufgezeichnet. Spektren wurden im Bereich von 200–1000 nm in Wasser mit einer Scangeschwindigkeit von 200 nm min−1 und einer spektralen Bandbreite von 2 nm gemessen. Die Emissionsspektren wurden mit einem Acton SP2300i-Spektrometer gemessen, das mit einem InGaAs-Linear-Array-Detektor (Princeton OMA-V) ausgestattet war. Die Quantenausbeuten wurden mit der integrierten Kugelmethode gemessen. ESI-MS-Analysen wurden mit Bruker MicroTOF-Q II durchgeführt; Die Probe wurde mit einer Spritzenpumpe mit 3 µL/min eingeführt und die vollständigen MS-Scan-Spektren wurden im Negativionenmodus gesammelt. Die Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) wurde auf einem Thermo Scientific ICAP 6300 Duo View-Spektrometer durchgeführt. Die Infrarotspektren wurden mit dem Nicolet iS50 FT/IR-Spektrometer gemessen. Der PC-Ligand, der Au-GSH-Cluster und das Au-PC-Konjugat wurden auf ein internes Diamantreflexionselement (IRE) getropft und an der Luft trocknen gelassen. IR-Spektren wurden im ATR-Modus gemessen. Die Spektren wurden mit einer spektralen Auflösung von 4 cm−1 im Bereich 400–4000 cm−1 aufgenommen.

3 µL Au-GSH- und Au-PC-Proben (Konzentration: 6,0 µg/µL) wurden auf ein glimmentladenes R1.2/1.3 Quantifoil-Gitter aufgetragen. Die Gitter wurden mit Filterpapier abgetupft, um die überschüssige Probe zu entfernen, und mit Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, USA) schnell in flüssiges Ethan getaucht. Die TEM-Bilder wurden mit einem Kryo-Elektronenmikroskop Titan Krios G3 (Thermo Fisher Scientific, USA) mit einem K3-Direktelektronendetektor mit einer beschleunigten Spannung von 300 kV aufgenommen. Mikroaufnahmen wurden bei einer Defokussierung von −1,0 µm mit einer Pixelgröße von 1,08 Å und einer Elektronendosis von 30 e-/Å2 aufgenommen.

Die absoluten Quantenausbeuten von Au-GSH und Au-PC wurden mit einer integrierten Kugel (Thorlabs; IS200) gemessen. Die Sonden wurden mit einem 808-nm-Laser angeregt und die Emission im Bereich von 900 bis 1500 nm gesammelt. Nach der Ausbreitung des einfallenden Lichts durch eine integrierte Kugel wurde das resultierende Licht mithilfe eines selbstgebauten NIR-Spektrographen mit einem Spektrometer (Acton SP2300i) gesammelt, das mit einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten linearen InGaAs-Array-Detektor (Princeton OMA-V) ausgestattet war. Die absoluten Quantenausbeuten wurden nach folgender Gleichung berechnet:

Dabei ist QY die Quantenausbeute, E[Probe] die Emissionsintensität und L[Blank] und L[Probe] die Intensitäten des Anregungslichts in Gegenwart von Wasser bzw. der NIR-II-Sondenprobe.

Die Zytotoxizität von Au-GSH und Au-PC auf 4T1-Mäuse-Brustkrebs- (ATCC CRL-2539) und CT26-Dickdarmkrebs-Zelllinien (ATCC CRL-2638) wurde mithilfe des MTS-Assays (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega) bewertet ). Die in dieser Studie verwendeten Zelllinien wurden negativ auf eine Mykoplasmeninfektion getestet. Die Zellen wurden mit 5 × 103 Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin-Antibiotika, ausgesät und 24 Stunden lang zur Anheftung belassen. Nach 24-stündiger Inkubation in einer feuchten Atmosphäre von 5 % CO2 bei 37 °C wurden die Zellen zweimal mit 200 μl Basismedium gewaschen und anschließend wurden jeder Vertiefung dreifach unterschiedliche Konzentrationen an Au-GSH und Au-PC zugesetzt. Nach 12 Stunden Internalisierung wurden die Zellen dreimal mit Medium gewaschen und dann wurde MTS in jede Vertiefung gegeben. Die Absorption wurde 4 Stunden nach der Inkubation mit einem Multiplate Reader (Tecan) gemessen.

Alle Tierversuche wurden vom Stanford Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Die Verfahren wurden gemäß dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. 3–9 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (Gewicht: 15–20 g) wurden von Charles River gekauft. Die Mäuse wurden im Veterinary Service Center der Stanford University bei einer Umgebungstemperatur von 20–25 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50–65 % bei 12 Stunden Licht/12 Stunden Dunkelheit gehalten. Die Einstreu, Nistmaterial, Futter und Wasser wurden von der Stanford VSC-Einrichtung bereitgestellt. Vor jedem Experiment wurden die Mäuse mit einer Haarentfernungslotion (Nair, Softening Baby Oil) rasiert. Für die In-vivo-Bildgebung wurden die Mäuse mit 2,5 % Isofluran und Sauerstoff als Trägergas bei einer Flussrate von 2 l/min anästhesiert. Gemäß den Tierpflegeprotokollen wurden die Mäuse während des Bildgebungsprozesses und der Zeit nach der Genesung sorgfältig überwacht. Die Versuchsgruppen bestanden aus n = 3 Mäusen. 4T1-Brustkrebszellen der Maus und CT26-Dickdarmkrebszellen wurden auf beide Hinterbeine der Mäuse geimpft und nach einigen Tagen wuchsen syngene 4T1- und CT26-Tumoren. Die Tierversuche wurden durchgeführt, als der Tumor ~15 mm3 erreichte. Die maximal zulässige Tumorgröße für eine Maus mit einem oder zwei Tumoren betrug 2,46 cm3 und 2,5 cm3 gemäß den Richtlinien des Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) der Stanford University. Die Tiere wurden mittels Isofluran-Induktion (3–5 % Isofluran und Sauerstoff als Trägergas bei einer Flussrate von 2 l/min) auf humane Weise eingeschläfert, gefolgt von einer Zervixluxation.

Die Tierversuche und die Bildgebung im NIR-II-Fenster wurden in einem zweidimensionalen, wassergekühlten 640 × 512 InGaAs-Array (Ninox 640, Raptor Photonics) durchgeführt. Die Cluster wurden durch einen 808-nm-Dauerstrich-Diodenlaser mit einer Leistungsdichte von 70 mW/cm2 angeregt. Sofern nicht anders angegeben, wurde in allen Bildgebungsexperimenten ein 1100-nm-Langpassfilter verwendet. Die fluoreszierenden Sonden wurden über die Schwanzvene (intravenös, iv), die Schwanzbasis (subkutan, sc) und (peri)intratumoral (it) verabreicht. NIR-II-Fluoreszenzbilder wurden nach 3 Minuten, 10 Minuten, 30 Minuten, 1 Stunde, 3 Stunden, 6 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden pi aufgenommen

Die Bioverteilung der Sonden wurde 10 Minuten, 30 Minuten, 24 Stunden oder 48 Stunden nach der Verabreichung analysiert. Der Urin, der Kot und die wichtigsten Organe, einschließlich Leber, Milz, Herz, Lunge und Nieren, wurden gesammelt und 12 Stunden lang in Salpetersäure (68 %) verdaut. Anschließend wurden die Lösungen in der Aufschlusslösung (Salpetersäure:Wasserstoffperoxid = 4:1) auf 150 °C erhitzt, bis eine transparente und farblose Lösung entstand. Die Goldkonzentration in jeder Probe wurde mittels ICP-MS (Thermo Scientific ICAP 6300 Duo View Spectrometer) gemessen.

Das Softwarepaket LabView2009 wurde für die Bildgebung der Tiere, die Neukodierung von Videos und die synchrone Steuerung der Laserbelichtung verwendet. Die Rohbilder wurden mit ImageJ 2.1 verarbeitet und analysiert. Die kristallographische Darstellung der Clusterstruktur wurde mit dem UCSF Chimera-Programm (Version 1.12) auf der Grundlage der in Referenz 46 veröffentlichten Kristallstrukturdaten erstellt.

Die Diagramme wurden mit dem Softwarepaket Origin 2021 erstellt. Statistische Analysen wurden mit der in Origin verfügbaren Paired-Vergleichs-App durchgeführt (Mittelwertvergleichsmethode: Tukey, einseitig). P-Werte von <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Fehlerbalken stellten die Standardabweichung (SD) von drei wiederholten Experimenten dar. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Die Probengrößen wurden auf der Grundlage umfangreicher Erfahrungen mit Tierversuchen zur Lymphknotenbildgebung ausgewählt. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt. Die Mäuse wurden zufällig aus den Käfigen ausgewählt und dann in Studiengruppen eingeteilt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel, in den Zusatzinformationen und in der Quelldatendatei verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Rohdaten der Massenspektrometrie finden Sie im öffentlichen Repository (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20445561.v1). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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AB dankt dem Schweizerischen Nationalfonds für die finanzielle Unterstützung (Early Postdoc Mobility, Grant P2GEP2_191466). Diese Studie wurde auch vom National Institutes of Health NIH DP1-NS-105737 unterstützt. AB dankt Stanford Animal Histology Services (AHS) und HistoTek für ihre Hilfe bei der H&E-Färbung von Gewebeschnitten sowie dem Stanford Diagnostic-Labor für Blutanalysen und Zelllinientests. AB dankt dem Massenspektrometriedienst der Stanford University und Theresa McLaughlin für ESI-MS-Analysen.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ani Baghdasaryan, Feifei Wang.

Abteilung für Chemie und Bio-X, Stanford University, Stanford, CA, 94305, USA

Ani Baghdasaryan, Feifei Wang, Fuqiang Ren, Zhuoran Ma, Jiachen Li, Chun Xu und Hongjie Dai

Abteilung für Bioingenieurwesen, School of Engineering, Stanford University, Stanford, CA, 94305, USA

Xueting Zhou

Institut für Immunologie, Transplantation und Infektionskrankheiten, Abteilung für Pathologie, Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, School of Medicine, Stanford University, Stanford, CA, 94305, USA

Lilit Grigoryan

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HD und AB konzipierten und gestalteten die Experimente. AB und FW führten die Experimente durch. AB, FW, FR, ZM, JL, XZ, LG, CX und HD analysierten die Daten. AB und HD haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren trugen zur allgemeinen Diskussion und Überarbeitung des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Hongjie Dai.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Xiaodong Zhang, Jie Zheng und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Baghdasaryan, A., Wang, F., Ren, F. et al. Phosphorylcholin-konjugierte Gold-Molekülcluster verbessern das Signal für die Lymphknoten-NIR-II-Fluoreszenzbildgebung in präklinischen Krebsmodellen. Nat Commun 13, 5613 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33341-6

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Eingegangen: 20. Januar 2022

Angenommen: 13. September 2022

Veröffentlicht: 24. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33341-6

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